凍結耐性を付与する筋組織ビルドアップ法の確立と力学特性評価

本研究課題では、遺伝子操作を用いた筋細胞組織の凍結耐性付与法の確立を目標とし、本年度の研究成果は以下の3項目を実施した.1)筋芽細胞への目的遺伝子導入最適化2)筋組織形成後の目的タンパク質発現効率の評価3)標的遺伝子を保持した安定発現細胞株のクローニングとその評価4)トレハローストランスポーター発現筋組織の凍結耐性の評価1)では、マウス由来の筋芽細胞株C2C12へのTret1遺伝子の効率的な遺伝子導入方法を検討した.先ず、従来の遺伝子導入方法では、細胞全体の数%のみの遺伝子導入効率であったのに対して、培養基板に接着タンパク質コーティング(MatriGel^<TM>)を処理することによって、30-60%程度まで導入効率が高まることを見いだした.2)では、遺伝子導入後のC2C12細胞に筋組織形成の分化誘導を促し、目的タンパク質を強制発現し、その細胞集団から筋細胞組織を形成する実験を行った.その結果、筋組織形成に必要な10日間を経た後において、目的タンパク質を保持した細胞は数%程度に減少することが分かった.さらにこの発現細胞集団は筋組織への分化能を維持し、筋組織特有の筋管形状へ分化し、筋組織特有の電気刺激による収縮応答も確認することができた.3)では、目的遺伝子導入の処理後、薬剤選別による安定発現細胞株のクローニングを検討した.その結果、クローニング培養が3週間程度要する中で、目的タンパク質の発現量が減衰し、安定発現細胞株の発現効率は非常に低くなることが分かった.4)では、2)で作製した筋細胞組織をトレハロース含有培地の中で凍結の負荷を与えたところ、細胞膜が強固に保持されることが示され、トランスポータータンパク質の発現によって、筋組織の凍結耐性が向上することが明らかとなった.

本研究課題では、遺伝子操作を用いた筋細胞組織の凍結耐性付与法の確立を目標とし、本年度の研究成果は以下の3項目を実施した.1)筋芽細胞への目的遺伝子導入最適化2)筋組織形成後の目的タンパク質発現効率の評価3)標的遺伝子を保持した安定発現細胞株のクローニングとその評価4)トレハローストランスポーター発現筋組織の凍結耐性の評価1)では、マウス由来の筋芽細胞株C2C12へのTret1遺伝子の効率的な遺伝子導入方法を検討した.先ず、従来の遺伝子導入方法では、細胞全体の数%のみの遺伝子導入効率であったのに対して、培養基板に接着タンパク質コーティング(MatriGel^<TM>)を処理することによって、30-60%程度まで導入効率が高まることを見いだした.2)では、遺伝子導入後のC2C12細胞に筋組織形成の分化誘導を促し、目的タンパク質を強制発現し、その細胞集団から筋細胞組織を形成する実験を行った.その結果、筋組織形成に必要な10日間を経た後において、目的タンパク質を保持した細胞は数%程度に減少することが分かった.さらにこの発現細胞集団は筋組織への分化能を維持し、筋組織特有の筋管形状へ分化し、筋組織特有の電気刺激による収縮応答も確認することができた.3)では、目的遺伝子導入の処理後、薬剤選別による安定発現細胞株のクローニングを検討した.その結果、クローニング培養が3週間程度要する中で、目的タンパク質の発現量が減衰し、安定発現細胞株の発現効率は非常に低くなることが分かった.4)では、2)で作製した筋細胞組織をトレハロース含有培地の中で凍結の負荷を与えたところ、細胞膜が強固に保持されることが示され、トランスポータータンパク質の発現によって、筋組織の凍結耐性が向上することが明らかとなった.