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大腸菌を用いたＧＰＣＲ　細胞外ドメイン調製法の開発とその立体構造解析への応用

大肠杆菌GPCR胞外结构域制备方法的建立及其在三维结构分析中的应用

基本信息

批准号：
12J03410
负责人：
片岡沙織
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J03410/
关键词：
蛋白質 GPCR 可用性蛋白質 G蛋白質共役型受容体 pCold-GST

项目摘要

昨年度、pCold-GSTシステム、クラスBに属する9種類の受容体のN末端細胞外ドメインを用いて、試料調製を行ったところ、9種類中7種のN末端細胞外ドメインを、可溶性画分で発現させることに成功した。この時、pCold-GSTシステムとシャペロンを共発現させるコンピテントセルを用いることで、可溶性画分での発現が良くなることを見出した。そこで、可溶性画分での発現に、どのシャペロンと組み合わせて発現させることが有効なのかを、検証した。結果、試したシャペロンのほぼ全てで、昨年度使用したシャペロンと同様の効果を表すことが明らかになった。また、これらの成果を論文にするために、データの精密化を行った。さらに、クラスBに属するGPCRのN末端細胞外ドメインの試料調整法の確立に留まらず、まだ立体構造が明らかになっていない他のタンパク質に、pCold-GSTシステムを適用することで、大腸菌を用いた簡便な試料調製技術の確立を行った。その結果、他のタンパク質の発現や可用性タンパク質の生産にも成功し、溶液NMRを用いて、立体構造を決定することに成功した。また、このシステムでタンパク質の発現に成功したことで、相互作用実験を行う事を可能にした。この研究では、発現が困難であったり、可溶性タンパク質の生産が困難なタンパク質の試料調製法の確立を目的とした。結果、採用期間内で、新規大腸菌発現系システムpCold-GSTを用いて、クラスBに属するヒトGPCRの細胞外ドメインの試料調製技術の開発と、pCold-GSTシステムの有効性と、応用力の高さを明らかにすることに成功した。

In the past year, the N-terminal extracellular domain of 9 kinds of receptors belonging to pCold-GST system and C-GST system was successfully developed, and the N-terminal extracellular domain of 7 kinds of receptors belonging to 9 kinds was successfully developed. The time, the p-GST system, the soluble system. In addition, the soluble protein can also be detected by the enzyme. The results of the trial were as follows: The results of the study are as follows: The establishment of sample conditioning method for N-terminal extracellular domain of GPCR belonging to the group B and the establishment of simple sample conditioning technology for Escherichia coli. The results show that the quality of the product can be determined by NMR. The interaction between them is possible. This research is very difficult to find, and the production of soluble substances is very difficult to establish. Results: During the period of adoption, the new Escherichia coli production system pCold-GST was successfully developed, and the extracellular GPCR sample preparation technology was successfully developed.