樹状細胞由来破骨細胞を中心とした歯周炎病態形成機構の＂骨免疫学＂的視点からの解明

从“骨免疫学”角度阐明以树突状细胞源性破骨细胞为中心的牙周炎发病机制

• 批准号: 12J05841
• 负责人: 河田 恵子
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J05841/
• 关键词: 分化誘導; 転写調節系の分子解剖; TALエフェクター; p63遺伝子

ESTファミリー転写因子PU.1は主に骨髄球系前駆細胞に発現し、成人型造血における細胞の運命選択に重要な役割を果たす。しかし、PU.1遺伝子の発現が転写因子ネットワーク内でどのように同細胞の分化を制御しているのか、そのメカニズムは十分に解明されていない。本研究の目的は、転写因子PU.1を中心とするゲノムワイド転写因子マップを作成することで、そのため標的ゲノム編集技術であるTALEを用いてPU.1のエンハンサーの修飾を試みた。この修飾によりPU.1遺伝子の発現レベルを変化させることで生じる転写因子ネットワークの変化を単一細胞レベルで解析することとした。本研究においては、まず造血幹細胞および造血前駆細胞の運命を決定づける転写制御の分子機構を明らかにするのに必要なTALEを用いた解析法の開発に取り組んだ。ES細胞のPU.1の転写開始点下流14kbに存在するエンハンサーにTALEを用いて転写活性化ドメインVP64あるいは転写抑制ドメインKRABをコードするDNAを導入し、 EB(EB: 胚様体)を形成させた。導入したDNAにはドキシサイクリン標識を行い、PU.1およびそれに隣接した遺伝子群の発現に及ぼす影響と造血細胞分化へ及ぼす効果を解析した。その結果、TALEを用いた標的ゲノム編集と単一細胞レベルでの遺伝子発現プロファイリングを組み合わせた方法が、遺伝子レベルでの細胞分化調節ネットワークの解析に有用であることが明らかとなった。本研究で実施したTALEを用いたPU.1-14kbの活性化によって細胞表面抗原の発現量は変化し、造形細胞への運命決定が促進されることが示された。すなわち、単一細胞遺伝子発現解析の結果、PU.1-14kbの活性化は同細胞内の転写因子ネットワークが内皮系から造血系へと推移させた。本研究はPU.1-14kbの造血細胞分化に果たす重要性を明らかにしたばかりでなく、遺伝子ネットワーク解析におけるTALEを用いた標的ゲノム編集の有用性を示した。

EST gene expression factor PU.1 plays an important role in the development of primary hematopoietic cells and in the selection of adult hematopoietic cells. The expression of PU.1 gene is very important for the development of cell differentiation. The purpose of this study is to test the modification of PU.1 by using TALE. This modification involves the development of a PU.1 gene and the analysis of a single cell. This study is aimed at identifying the molecular mechanisms necessary for the development of hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells by analytical methods. 14kb downstream from the transcription start point of PU.1 in ES cells, DNA was introduced and EB(EB: embryo) was formed using TAE as a transcription activator and VP64 as a transcription inhibitor. The introduction of DNA into the cell line, PU.1 and PU.2 affected the development of hematopoietic cells and their effects. The results, TALE, and the use of the target must be compiled and analyzed in a single cell. In this study, TALEs were used to activate PU.1-14kb, to stimulate cell surface antigen production, and to shape cell fate. The results of analysis of cellular gene expression, PU.1-14kb activation, and intracellular gene expression in endothelial cells and hematopoietic cells This study demonstrates the importance of PU.1-14kb in hematopoietic cell differentiation and the usefulness of TAE target compilation.

项目成果

Analysis of haematopoietic transcription factor networks using TALEs

使用 TALE 分析造血转录因子网络

• 发表时间: 2015
• 作者: Wilkinson AC*;Kawata VK*;Judith Schutte;Gao X;Antoniou S;Baumann C;Woodhouse S,Hannah R;Tanaka Y;Swiers G;Moignard V;Fisher J;Shimauchi H;Tijssen MR;de Bruijn MF;Liu P;Gottgens B. (*共同第一著者);河田恵子
• 通讯作者: 河田恵子