個体応用を指向した新規レポータータンパク質システムの創製

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本研究の目的である生物個体におけるタンパク質解析に向けて、前年度に引き続き、レポータータンパク質システムの構築に取り組んだ。具体的には、生体透過性にすぐれ生物個体応用が期待される核磁気共鳴技術 (NMR) を用いたレポータータンパク質システムの構築を目指した。実際に、マウス由来の乳酸脱水素酵素、及び同位体標識したピルビン酸誘導体を用いることにより、大腸菌や真核細胞におけるタンパク質発現を検出可能であることを実証した (Chem. Lett. 2014, 43, 1873)。レポーターであるマウス由来の乳酸脱水素酵素は同位体標識したピルビン酸誘導体と選択的に反応し、2位の炭素に対して新たに1Hを付加し1H-13C2-13C1配列を形成する。そのため、レポータータンパク質に由来する本配列上の1Hを多重共鳴NMRにより選択的に検出することでタンパク質の発現を解析した。また、本年度は、タンパク質解析方法の拡充に向け内因性酵素の活性を検出するNMR分子プローブ設計を行った。具体的には、分子プローブのNMRシグナルを劇的に増強可能な動的核偏極技術を用いた酵素活性評価法の確立を目指した。設計したNMR分子プローブは、標的酵素との反応に伴い同位体標識部位のケミカルシフトが変化する。そのため、それぞれのケミカルシフトにおけるNMRシグナルを計測することで酵素活性評価が可能となる。実際に、動的核偏極技術を用いることにより、組織破砕液中に含まれる標的酵素の活性を高感度に検出可能であることを明らかにした。