繊毛・鞭毛の機能的多様性とチューブリンポリグルタミル化の関連性に関する研究

纤毛和鞭毛功能多样性与微管蛋白多聚谷氨酰化关系的研究

基本信息

批准号：
12J06986
负责人：
紺野在
金额：
$ 2.32万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までの研究から、チューブリンポリグルタミル化酵素Ttll9を欠損する雄マウスは雄性不稔を示すことを明らかにした。またTtll9欠損精子は精子頭部のフックのカーブと反対方向（アンチフック側）に屈曲した後で一過的に停止（アンチフックストール）しやすい傾向が見られた。本年度はアンチフックストールの原因を詳細に調査した。最初に軸糸微小管の配置と頭部のフックの方向との相対位置関係を明らかにするため、透過型電子顕微鏡観察を行った。その結果、マウス精子ではダブレット5-6番がアンチフック側に位置していることが明らかになった。続いて、Ttll9欠損マウス精子のポリグルタミル化レベル低下と、アンチフックストールの関連性について検討を行った。申請者はTTLL9の各ダブレットへの親和性が異なり、特定のダブレットをより強く修飾しているのではないかと考えた。この仮説をテストするため、精子をpost-embeddingイムノゴールド法を用いて染色し、9本のダブレット微小管および中心対微小管を標識する金コロイドを計数した。コントロールとして用いた抗チューブリン抗体では全ての微小管サブセットが均一に標識された。野生型マウスについては精子軸糸の9本のダブレット微小管のうち、1, 5, 6, 9番ダブレットのポリグルタミル化レベルが高いという過去の報告を再現した。一方、Ttll9欠損精子の鞭毛では、全体に修飾レベルが低下し、中でもダブレット5番のポリグルタミル化低下レベルが最も大きいことが示唆された。ダブレット5番はアンチフック側への屈曲から反対方向への屈曲の切り替え地点に位置するダブレットである。従って、Ttll9欠損精子ではダブレット5番のポリグルタミル化レベル低下が大きいことにより、アンチフック側からプロフック側への屈曲切り替えが阻害される傾向にあると考えられる。

直到去年的研究表明，缺乏微管蛋白聚谷氨基酶TTLL9的雄性小鼠表现出雄性不育。此外，TTLL9缺陷的精子倾向于沿相反方向弯曲（反钩侧）与精子头的钩曲线，然后停止（防钩失速）。今年，我们详细调查了反煮摊位的原因。首先，为了阐明轴向螺纹微管的排列与头钩的方向之间的相对位置关系，使用透射电子显微镜进行了观测。结果，揭示了双重5-6位于小鼠精子中的抗钩侧。接下来，我们研究了TTLL9缺陷小鼠精子和抗烟失速中较低的聚谷氨酰化水平之间的关联。申请人怀疑TTLL9对每个双线运动的亲和力都不同，这将使特定双重曲线更强。为了检验这一假设，使用后填充免疫金方法对精子进行染色，并计算中央对微管的金标记的9个双重微管和胶体。所有微管亚群均用用作对照的抗微管蛋白抗体均匀标记。在野生型小鼠中，我们再现了以前的报道，即双乙基1、5、6和9的聚谷氨酰化水平中的九个双轴螺纹螺纹的九个Doublet微管中很高。另一方面，鞭毛中TTLL9缺陷精子的总体修饰水平降低了，这表明Doublet 5处的聚谷氨酸水平最高。 Doublet No. 5是位于从弯曲到反钩侧到相反方向的开关点的双重脚。因此，人们认为缺乏TTLL9的精子倾向于抑制屈曲从抗钩侧转换为亲钩侧，因为DoubleT 5在多谷氨酰化水平的大幅度降低。