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ADLibシステムの改良による抗体エンジニアリング

通过改进ADLib系统进行抗体工程

基本信息

批准号：
12J08861
负责人：
黒澤恒平
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J08861/
关键词：
モノクローナル抗体 Cre-loxP Cre-Inシステム DT40 ヒト化 V(D)J組換え遺伝子変換

项目摘要

ニワトリB細胞由来DT40細胞を使ったモノクローナル抗体作製技術であるADLibシステムの高機能化を下記の2つのアプローチから行った。1. 機能性タンパク質融合抗体の作製前年度に開発したDT40細胞の抗体遺伝子のFc領域を迅速、簡単に改変することができるシステム(Cre-Inシステム)を利用して多機能性抗体の作製を行った。はじめに、Cre-Inシステムに対応した細胞株(Cre-In株、昨年度作製)からがん細胞のマーカーでもあるヒト上皮成長因子受容体(EGFR)に対する抗体を生産する細胞を獲得した。次に、Cre-Inシステムで蛍光タンパク質などの機能性タンパク質を融合した抗体を作製し、実用的に使用できること示した。また、機能性タンパク質を融合した抗体の精製法を検討し、効率的な精製方法を決定した。本研究の成果により、ADLibシステムで作製したモノクローナル抗体をCre-Inシステムを用いて簡単に加工できることを証明し、DT40細胞を抗体生産のツールとして利用することの優位性を示した。2. ADLib抗体の完全ヒト化ヒト染色体導入DT40細胞株を用いてV(D)J組換えによる抗体遺伝子の多様化について実験的検証を行った。前年度の研究で、DT40細胞内のヒト染色体では、抗体遺伝子の多様化を司るV(D)J組換えが作動可能な段階にあることが明らかとなった。そこで、V(D)J組換えに必須のタンパク質であるRAG1とRAG2を利用し、人為的に組換えを誘導するシステムの構築を検討した。しかし、ヒト染色体上でV(D)J組換えを引き起こすことはできなかった。そのため、現在は、1)遺伝子ターゲッティング法によるニワトリ抗体遺伝子のヒト化と、2)V(D)J組換え済みのヒト染色体をDT40細胞に移植する方法の2つのアプローチからADLib抗体の完全ヒト化に向けた実験を行っている。

The origin of DT40 cells is to make the ADLib system highly functional. 1. The Fc domain of the antibody gene of DT40 cells was rapidly and simply changed during the development of functional protein fusion antibodies and the production of multifunctional antibodies. Cell lines (Cre-In strain, produced last year) were obtained from cells that produce antibodies to epidermal growth factor receptors (EGFR). In addition, Cre-In-System is a functional system for the production and use of antibodies. To determine the purification method of functional fusion antibody The results of this study demonstrate the superiority of antibody production in DT40 cells by simplifying the processing of antibody production in ADLib cells 2. Complete chromosome transformation of ADLib antibody into DT40 cell line was carried out using V(D)J group transformation to detect the diversity of antibody genes. In the previous year's research, the chromosome of DT40 cells was changed, and the diversity of antibody genes was changed. The V(D)J group was changed, and the action level was changed. A discussion on the construction of a system that requires the use of RAG1 and RAG2 and that is induced by artificial changes. The V(D) group on the chromosome is replaced by the V(D) group on the chromosome. 1) The method of gene transformation, 2) The method of V(D) group J transformation, 2) The method of complete transformation of ADLib antibody into DT40 cells.