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蛋白質相互作用の速度論的調節機構に関する構造細胞生物学的研究

蛋白质相互作用动力学调控机制的结构细胞生物学研究

基本信息

批准号：
12J30003
负责人：
小山昌子
金额：
$ 2.53万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Xpo1p (exportin 1, CRM1)は代表的なexportinであり、ロイシンリッチ核外輸送シグナル（NES）をもつ多様なcargoを核から細胞質へ一方向に輸送する。細胞内において輸送が効率的に行われるためには、核内でXpo1pがRanGTP依存的にcargoを積込む反応（核外輸送複合体の形成反応）が速やかに起こる必要がある。我々はこれまでに、核内に局在するRan結合蛋白質Yrb2pがXpo1p核外輸送複合体形成の反応速度を劇的に上昇させることを見出し、反応中間体に相当するXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体の結晶構造を2.22 A分解能で解いた。さらにXpo1p-cargo-RanGTP複合体（核外輸送複合体）の結晶構造も2.15 A分解能で解き、これらの構造比較からYrb2pによるXpo1p核外輸送複合体の形成促進機構のモデルを推測した。これまで、構造情報に基づいて作成した変異体を用いてin vitroおよびin vivoの検証実験を行いモデルを支持する結果を得てきたが、本年度はさらなる検証実験を行い、核内におけるYrb2pの作用機構を確立した。第一に、Yrb2pのRanBDがXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体から解離する反応のキネティクスを解析するための実験系を確立し、cargoがXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体に結合することによりYrb2pのRanBDの解離を促進することを明らかにした。また、出芽酵母の生細胞を用いてNuclear transport assayを行い、Yrb2pのFGリピートの機能的重要性を検証した。さらに、出芽酵母の生細胞内でYFP-Xpo1pとCFP-Yrb2p間で起こるFRETをacceptor photobleachingにより検出し、Xpo1pとYrb2pの核内における結合が、Xpo1pによるcargo核外輸送において重要であることを示した。以上の結果をまとめて、Cell Reports誌に論文を発表した。

Xpo1p (exportin 1, CRM1) represents exportin, exportin. Intracellular transport efficiency is essential for rapid initiation of transport, nuclear transport and GTP dependent cargo accumulation. The crystal structure of Xpo1p-Yrb2p-RanGTP complex, which is an intermediate of Ran-binding protein Yrb2p and Xpo1p, can be resolved by 2.22A decomposition energy. The crystal structure of Xpo 1p-cargo-RanGTP complex (extranuclear transport complex) was analyzed by 2.15 A decomposition energy. The structure comparison of Xpo 1p-cargo-RanGTP complex and its formation promotion mechanism were proposed. This information is based on the creation of a variety of applications in vitro and in vivo, and results in the establishment of an operational mechanism for this year's verification process and in vivo. First, Yrb2p and RanBD are dissociated from each other. Second, Yrb2p and RanBD are dissociated from each other. Third, the system is established. Second, Yrb2p and RanBD are dissociated from each other. Third, Yrb2p and RanBD are dissociated from each other. To demonstrate the importance of the function of Yrb2p in the Nuclear transport assay In the budding yeast cell, YFP-Xpo1p and CFP-Yrb2p are involved in the initiation of FRET acceptor photoleaching, Xpo1p and Yrb2p are involved in the binding of Xpo1p and Yrb2p, and Xpo1p is involved in the transport of cargo out of the nucleus. The above results are presented in Cell Reports.