局所的BAC物理地図構築における革新的高速化技術の開発

27年度には、本研究の基盤的技術である極微量DNA増幅技術をシロイヌナズナ染色体のナノサイズ断片に実際に適用し、増幅のさらなる安定化と高い確実性を目指して検討を進めた。また近年急速に次世代シーケンサーが普及したことから当初計画の一部を変更し、BACクローンの作成にこだわらずに次世代シーケンサーに適合したライブラリ作成を目標に加えた。その結果、ナノサイズ染色体断片に含まれるDNA由来の増幅産物を75%以上の高い確率で取得する方法の確立に至り、次世代シーケンサーによる塩基配列解析に必要なサンプルを取得した。その際、極微量DNAの増幅には外部プライマーを使用せず、プライマーゼを利用する方法が非特異的DNA増幅の抑制と高い確率での増幅産物の取得に対して有効であることが明らかとなった。これに先立ち、25年度には染色体切断回収技術の確立を目指し、ゲノムサイズが植物として最小レベルのシロイヌナズナを対象として、染色体試料の作成、原子間力顕微鏡の操作の最適化を中心に実施した。その結果、染色体の任意の領域について切断回収することを実現した。また26年度には、主として1～2分子のDNAを鋳型としたDNA増幅、DNA増幅の障害となる染色体タンパクの除去法、外部DNA混入対策技術の開発を中心に検討を実施した。その結果、一連のDNA増幅工程において染色体ナノサイズ断片からのDNA増幅に必要な実験的条件を明らかにすることができた。これらのことにより、染色体標本の任意の領域のナノサイズ染色体断片作成とそれに含まれるDNAの塩基配列解析の一連の工程における必要な諸条件を明らかにすることができたと考えられ、局所的染色体物理地構築の革新的高速化について一定の成果を得た。一方、増幅されたDNAの鋳型特異性のさらなる向上など、今後の検討を要する課題も明らかとなった。

27年度には、本研究の基盤的技術である極微量DNA増幅技術をシロイヌナズナ染色体のナノサイズ断片に実際に適用し、増幅のさらなる安定化と高い確実性を目指して検討を進めた。また近年急速に次世代シーケンサーが普及したことから当初計画の一部を変更し、BACクローンの作成にこだわらずに次世代シーケンサーに適合したライブラリ作成を目標に加えた。その結果、ナノサイズ染色体断片に含まれるDNA由来の増幅産物を75%以上の高い確率で取得する方法の確立に至り、次世代シーケンサーによる塩基配列解析に必要なサンプルを取得した。その際、極微量DNAの増幅には外部プライマーを使用せず、プライマーゼを利用する方法が非特異的DNA増幅の抑制と高い確率での増幅産物の取得に対して有効であることが明らかとなった。これに先立ち、25年度には染色体切断回収技術の確立を目指し、ゲノムサイズが植物として最小レベルのシロイヌナズナを対象として、染色体試料の作成、原子間力顕微鏡の操作の最適化を中心に実施した。その結果、染色体の任意の領域について切断回収することを実現した。また26年度には、主として1～2分子のDNAを鋳型としたDNA増幅、DNA増幅の障害となる染色体タンパクの除去法、外部DNA混入対策技術の開発を中心に検討を実施した。その結果、一連のDNA増幅工程において染色体ナノサイズ断片からのDNA増幅に必要な実験的条件を明らかにすることができた。これらのことにより、染色体標本の任意の領域のナノサイズ染色体断片作成とそれに含まれるDNAの塩基配列解析の一連の工程における必要な諸条件を明らかにすることができたと考えられ、局所的染色体物理地構築の革新的高速化について一定の成果を得た。一方、増幅されたDNAの鋳型特異性のさらなる向上など、今後の検討を要する課題も明らかとなった。