ヒトＡＩＤ細胞を利用したＤＮＡ複製時ゲノム安定維持因子探索と機能の解明

損傷によるDNA複製の障害を取り除き複製を再開することは、ゲノム安定化に重要である。しかしながら、この過程には多数の修復経路関連タンパク質が関与する事に加え、DNA複製反応自体の複雑性もあいまって理解が進んでいない分野である。特に、ヒトにおいては、複製フォークでの損傷により誘発される相同組換え修復のDNA strand invasion以降の反応および修復完了後の複製再開機構に関する因子とそのメカニズムの理解はほぼ皆無である。そこで本研究では、複製フォークと相同組換え修復の理解を深める為に、DNA損傷時、組換え修復依存的に複製フォークに集積する因子を網羅的に同定・解析することにより、組換え修復と複製反応の共役性をヒト細胞レベルで解析することを目的としている。しかし、相同組換え修復やDNA複製反応に関わる因子は、生存に必須である事が多く、欠損株の樹立が困難であった。そのため、まず初めにこの問題を克服する為の新しい実験系の樹立が必要であった。近年急速な進展をみせているゲノム編集法(CRISPR/Cas9システム)と、受入研究室が開発したAID(auxin inducible degron)法とを組み合わせることで、ヒト細胞において標的因子を速やかに除去することが可能なコンディショナル変異細胞(AID細胞)の樹立が可能であり、上記の問題を克服するための手段として研究計画を進めた。本研究期間中、ヒト培養細胞を用いた実験の結果、AID標識した目的タンパク質を一過性に発現することができ、AID法により目的タンパク質の分解が観察できた。

損傷によるDNA複製の障害を取り除き複製を再開することは、ゲノム安定化に重要である。しかしながら、この過程には多数の修復経路関連タンパク質が関与する事に加え、DNA複製反応自体の複雑性もあいまって理解が進んでいない分野である。特に、ヒトにおいては、複製フォークでの損傷により誘発される相同組換え修復のDNA strand invasion以降の反応および修復完了後の複製再開機構に関する因子とそのメカニズムの理解はほぼ皆無である。そこで本研究では、複製フォークと相同組換え修復の理解を深める為に、DNA損傷時、組換え修復依存的に複製フォークに集積する因子を網羅的に同定・解析することにより、組換え修復と複製反応の共役性をヒト細胞レベルで解析することを目的としている。しかし、相同組換え修復やDNA複製反応に関わる因子は、生存に必須である事が多く、欠損株の樹立が困難であった。そのため、まず初めにこの問題を克服する為の新しい実験系の樹立が必要であった。近年急速な進展をみせているゲノム編集法(CRISPR/Cas9システム)と、受入研究室が開発したAID(auxin inducible degron)法とを組み合わせることで、ヒト細胞において標的因子を速やかに除去することが可能なコンディショナル変異細胞(AID細胞)の樹立が可能であり、上記の問題を克服するための手段として研究計画を進めた。本研究期間中、ヒト培養細胞を用いた実験の結果、AID標識した目的タンパク質を一過性に発現することができ、AID法により目的タンパク質の分解が観察できた。