ヒトＡＩＤ細胞を利用したＤＮＡ複製時ゲノム安定維持因子探索と機能の解明

使用人类 AID 细胞寻找在 DNA 复制过程中维持基因组稳定性的因素并阐明其功能

基本信息

批准号：
14J01370
负责人：
柳原啓見
金额：
$ 1.16万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J01370/
关键词：
タンパク質分解条件特異的変異体 auxin ゲノム編集 DNA複製相同組換え修復

项目摘要

損傷によるDNA複製の障害を取り除き複製を再開することは、ゲノム安定化に重要である。しかしながら、この過程には多数の修復経路関連タンパク質が関与する事に加え、DNA複製反応自体の複雑性もあいまって理解が進んでいない分野である。特に、ヒトにおいては、複製フォークでの損傷により誘発される相同組換え修復のDNA strand invasion以降の反応および修復完了後の複製再開機構に関する因子とそのメカニズムの理解はほぼ皆無である。そこで本研究では、複製フォークと相同組換え修復の理解を深める為に、DNA損傷時、組換え修復依存的に複製フォークに集積する因子を網羅的に同定・解析することにより、組換え修復と複製反応の共役性をヒト細胞レベルで解析することを目的としている。しかし、相同組換え修復やDNA複製反応に関わる因子は、生存に必須である事が多く、欠損株の樹立が困難であった。そのため、まず初めにこの問題を克服する為の新しい実験系の樹立が必要であった。近年急速な進展をみせているゲノム編集法(CRISPR/Cas9システム)と、受入研究室が開発したAID(auxin inducible degron)法とを組み合わせることで、ヒト細胞において標的因子を速やかに除去することが可能なコンディショナル変異細胞(AID細胞)の樹立が可能であり、上記の問題を克服するための手段として研究計画を進めた。本研究期間中、ヒト培養細胞を用いた実験の結果、AID標識した目的タンパク質を一過性に発現することができ、AID法により目的タンパク質の分解が観察できた。

由于损伤和重新启动复制而消除对DNA复制的损害对于基因组稳定很重要。但是，此过程涉及大量与修复途径相关的蛋白质，而DNA复制反应本身的复杂性本身是理解不进行的区域。特别是，在人类中，几乎没有理解有关DNA链入侵在复制叉时损坏引起的同源重组修复后的反应的因素和机制，以及在完成修复后恢复复制机制。因此，在这项研究中，为了加深对复制叉和同源重组修复的理解，我们旨在分析重组修复和在人类细胞水平上的复制反应的结合，通过全面识别和分析重组在重组型在DNA损伤方面依赖于重组的重组中的因素。然而，涉及同源重组修复和DNA复制反应的因素通常对于生存至关重要，因此难以建立有缺陷的应变。因此，首先有必要建立一个新的实验系统来克服这个问题。通过将近年来一直在迅速发展的基因组编辑方法（CRISPR/CAS9系统）与宿主实验室开发的AID（生长素诱导的DEGRON）方法相结合，可以建立有条件的突变细胞（AID细胞），可以快速确定人类细胞中的目标因素，并将研究计划作为克服上述问题。在这项研究中，使用人培养细胞的实验表明，可以暂时表达辅助标记的靶蛋白，并且可以使用AID方法观察靶蛋白的降解。