ヒトＡＩＤ細胞を利用したＤＮＡ複製時ゲノム安定維持因子探索と機能の解明

使用人类 AID 细胞寻找在 DNA 复制过程中维持基因组稳定性的因素并阐明其功能

• 批准号: 14J01370
• 负责人: 柳原 啓見
• 金额: $ 1.16万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J01370/
• 关键词: タンパク質分解; 条件特異的変異体; auxin; ゲノム編集; DNA複製; 相同組換え修復

損傷によるDNA複製の障害を取り除き複製を再開することは、ゲノム安定化に重要である。しかしながら、この過程には多数の修復経路関連タンパク質が関与する事に加え、DNA複製反応自体の複雑性もあいまって理解が進んでいない分野である。特に、ヒトにおいては、複製フォークでの損傷により誘発される相同組換え修復のDNA strand invasion以降の反応および修復完了後の複製再開機構に関する因子とそのメカニズムの理解はほぼ皆無である。そこで本研究では、複製フォークと相同組換え修復の理解を深める為に、DNA損傷時、組換え修復依存的に複製フォークに集積する因子を網羅的に同定・解析することにより、組換え修復と複製反応の共役性をヒト細胞レベルで解析することを目的としている。しかし、相同組換え修復やDNA複製反応に関わる因子は、生存に必須である事が多く、欠損株の樹立が困難であった。そのため、まず初めにこの問題を克服する為の新しい実験系の樹立が必要であった。近年急速な進展をみせているゲノム編集法(CRISPR/Cas9システム)と、受入研究室が開発したAID(auxin inducible degron)法とを組み合わせることで、ヒト細胞において標的因子を速やかに除去することが可能なコンディショナル変異細胞(AID細胞)の樹立が可能であり、上記の問題を克服するための手段として研究計画を進めた。本研究期間中、ヒト培養細胞を用いた実験の結果、AID標識した目的タンパク質を一過性に発現することができ、AID法により目的タンパク質の分解が観察できた。

Damage is an obstacle to DNA replication, and it is important to remove it and replicate it again, and to stabilize it.しかしながら、このPROCEDURE には多の修経路综合 タンパク性が关与する事に加え, DNA replication reflects the self's complex nature and understanding of the nature of DNA replication.特に, ヒトにおいては, replicated フォークでのdamage によりinducing 発される same group replacement and repair のDNA strand After the invasion, the counterattack was repaired, and the mechanism was copied and reopened.そこでThis study is based on the understanding of the same group replacement and repair, and when DNA is damaged, the group replacement and repair depend on the フォークにintegration The る factor を net's にdetermination・analysis することにより, replacement えrepair とreplication and reaction のmutual service をヒトcell レベルでanalysis することをpurpose としている.しかし, same group replacement and repair, DNA replication and reaction, わる factor, にnecessity for survival, である事が多く, and failure to establish a damaged strain, がdifficulty であった. It is necessary to overcome the problems of the first time and the first time in order to establish the new system. In recent years, rapid progress has been made in CRISPR/Cas9 technology and AID (auxin inducible) has been accepted into the laboratory. degron) method and とを group み合わせることで, ヒトcell において standard factor をspeed やかに することがpossible なコンディThe establishment of AID cells (AID cells) is possible, the problems mentioned above are the means to overcome, and the research plan is in progress. During the period of this study, the results of cultured cells and the quality of AID label were used. Transient に発appears することができ, AID method によりpurpose タンパク性のanalysis が観看できた.