転写共役修復開始反応の分子機能解析（遺伝性光線過敏症の分子基盤）

转录偶联修复起始反应的分子功能分析（遗传光敏性的分子基础）

• 批准号: 14F04093
• 负责人: 荻 朋男
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Nagoya University (2015-2016)Nagasaki University (2014)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14F04093/
• 关键词: TC-NER; RNA polymerase Ⅱ; Ubiquitination; UV sensitive syndrome; RNA polymerase II; Cockyane syndrome; ヌクレオチド除去修復機構; UVSSA; 紫外線高感受性症候群; RNAポリメラーゼII; ユビキチン化

We firstly generated a cell line library, in which each TC-NER factors (e.g. UVSSA or Usp7) is knocked out using CRISPR/Cas9 technique; To get insights into UVSSA-dependent RNA polIIo ubiquitination, we setup a SILAC-based quantitative proteomics method for efficiently isolation and enrichment of ubiquitinated peptides, in combination with high-resolution mass-spectrum and we successfully identified numbers of UV-damage specific and UVSSA-dependent ubiquitination sites on stalled RNA polIIo; To subsequently test the biological relevance of polIIo ubiquitination to TC-NER, the “non-ubiquitinable” mutant cell lines were generated and several generated mutant cell lines displayed reduced TC-NER activity and defects in RNA polIIo ubiquitination upon UV irradiation. To give a detail view of various TC-NER proteins in RNA polIIo ubiquitination, we have purified most of TC-NER factors including RNA polII, UVSSA, CSA/B, Cul4CSA E3 ligase and Usp7. By using these purified proteins, we set out to reproduce the RNA polIIo ubiquitination, a smear of RNA polIIo modification were observed by addition of RNA polII and Cul4CSA E3 ligase in reaction, which was previously reported. But after several attempts, so far we could not reproduce the UVSSA-specific RNA polII ubiquitination in test tube, implying that this reaction requires further factor (s) to complete. We are now setting up an proteomic method to identify potential factors that may involved in this process, and we believe the following work will provide further information for molecular basis of RNA polIIo ubiquitination.

我们首先建立了一个细胞系文库，其中每个TC-NER因子(如UVSSA或USP7)都被CRISPR/Cas9技术敲除；为了深入了解UVSSA依赖的RNA PolIIo泛素化，我们建立了基于SILAC的定量蛋白质组学方法，结合高分辨率质谱学，我们成功地在停滞的RNA polIIo上鉴定了许多UV损伤特异的和UVSSA依赖的泛素化位点；为了随后测试PolIIo泛素化与TC-NER的生物学相关性，我们产生了“非泛素化”突变细胞系，并且几个产生的突变细胞系在紫外线照射下表现出TC-NER活性降低和RNA PolIIo泛素化缺陷。为了详细了解各种TC-NER蛋白在RNA PolIIo泛素化中的作用，我们已经纯化了大部分TC-NER因子，包括RNA polII、UVSSA、CsA/B、Cul4CSA E3连接酶和USP7。通过使用这些纯化的蛋白质，我们开始复制RNA PolIIo泛素化，在反应中加入RNA polII和Cul4CSA E3连接酶，观察到RNA PolIIo修饰的涂抹，这是以前报道的。但经过几次尝试，到目前为止，我们还不能在试管中复制出UVSSA特异的RNA PolII泛素化，这意味着这个反应需要进一步的因素(S)才能完成。我们现在正在建立一种蛋白质组学方法来确定可能参与这一过程的潜在因素，我们相信以下工作将为RNA多聚泛素化的分子基础提供进一步的信息。

项目成果

TC-NER因子UVSSAによるRNAポリメラーゼIIのユビキチン化に関する分子機能解析

TC-NER因子UVSSA对RNA聚合酶II泛素化的分子功能分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 郭 朝万;中沢由華;嶋田繭子;唐田清伸;賈 楠;岡 泰由;宮﨑仁美;千住千佳子;荻 朋男
• 通讯作者: 荻 朋男

DNA修復・損傷応答機構の異常により発症する疾患の病態解明.

阐明 DNA 修复和损伤反应机制异常引起的疾病的病理学。

• 发表时间: 2017
• 作者: 荻朋男;中沢由華;唐田清伸;郭朝万;岡泰由;賈楠;嶋田繭子;宮﨑仁美;千住千佳子.
• 通讯作者: 千住千佳子.

Molecular and functional study on the initiation of transcription coupled nucleotide excision repair

转录偶联核苷酸切除修复启动的分子和功能研究

• 发表时间: 2014
• 作者: 郭朝万 ;中沢由華;嶋田繭子;賈楠;唐田清伸 ;宮崎仁美;荻朋男
• 通讯作者: 荻朋男

ゲノム不安定性を示す遺伝性疾患群の病態解析と新規疾患責任遺伝子変異探索

遗传疾病的病理分析显示基因组不稳定性并寻找导致新疾病的基因突变

• 发表时间: 2016
• 作者: 岩本和哉;高橋秀和;原口直紹;西村潤一;畑泰司;松田宙;水島恒和;山本浩文;土岐祐一郎;森正樹;中沢由華
• 通讯作者: 中沢由華

Genetics disorders associated with defects in transcription coupled nucleotide excision repair.

与转录缺陷耦合核苷酸切除修复相关的遗传性疾病。

• 发表时间: 2016
• 作者: 岡泰由;郭朝万;賈楠;唐田清伸;中沢由華;荻朋男.;荻朋男;荻朋男;荻朋男;Ogi T.;荻朋男;Ogi T.
• 通讯作者: Ogi T.