時間分解蛍光センサーを利用した細胞内シグナル分子の多成分同時イメージング法の開発

本研究では時間分解（Time-resolved : TR）蛍光センサーを用いた細胞内シグナル伝達物質の多成分同時イメージング法の開発を目的とする．特にCa2+とZn2+の動的挙動を同一細胞内で同時に可視化することによって，両者の協奏的な作用について新たな知見を得る．これを達成するため，申請者は次の３つの課題を設定した．①細胞内Zn2+放出に応答するTR型Zn2+蛍光センサーの開発．②TD蛍光イメージングシステムの構築．③TD蛍光測定法を利用したCa2+とZn2+の同時イメージング採用１年目の研究計画「細胞内Zn2+放出に応答するTR型Zn2+蛍光センサーの開発」本研究課題を遂行のためのTR型Zn2+蛍光センサーは，Zn2+選択性や光安定性などの一般的な蛍光センサーの性質に加え，i. 細胞質Zn2+検出に適したnMレベルの結合解離定数，ii. 細胞膜透過能，iii. 長時間の細胞内保持能などが要求される．申請者は上記の性能を満足する新規TR型Zn2+蛍光センサーEuTR-L1を開発した．EuTR-L1は光誘起電子移動（PET）機構により効率的な発光制御が可能となり，既報のTR型Zn2+蛍光センサーの中で最も高感度であることが示された．さらに，EuTR-L1のユーロピウム錯体部位のカルボキシル基をアセトキシメチル（AM）エステル化したEuTR-L1AMを用いて細胞内取り込み量，細胞内保持時間について評価した．ICP原子発光分析を用いて評価したところ，高濃度で細胞内に取り込まれ，一時間以上経過してもセンサーが留ることが明らかとなった．さらに独自に構築したTRイメージングシステムとEuTR－L1AMを用いて細胞内Zn2+イオンシグナルのTRイメージングを行ったところ高いS/N比でのイメージングに成功した．以上の結果から１年目の研究計画は達成できたと言える．

本研究では時間分解（Time-resolved : TR）蛍光センサーを用いた細胞内シグナル伝達物質の多成分同時イメージング法の開発を目的とする．特にCa2+とZn2+の動的挙動を同一細胞内で同時に可視化することによって，両者の協奏的な作用について新たな知見を得る．これを達成するため，申請者は次の３つの課題を設定した．①細胞内Zn2+放出に応答するTR型Zn2+蛍光センサーの開発．②TD蛍光イメージングシステムの構築．③TD蛍光測定法を利用したCa2+とZn2+の同時イメージング採用１年目の研究計画「細胞内Zn2+放出に応答するTR型Zn2+蛍光センサーの開発」本研究課題を遂行のためのTR型Zn2+蛍光センサーは，Zn2+選択性や光安定性などの一般的な蛍光センサーの性質に加え，i. 細胞質Zn2+検出に適したnMレベルの結合解離定数，ii. 細胞膜透過能，iii. 長時間の細胞内保持能などが要求される．申請者は上記の性能を満足する新規TR型Zn2+蛍光センサーEuTR-L1を開発した．EuTR-L1は光誘起電子移動（PET）機構により効率的な発光制御が可能となり，既報のTR型Zn2+蛍光センサーの中で最も高感度であることが示された．さらに，EuTR-L1のユーロピウム錯体部位のカルボキシル基をアセトキシメチル（AM）エステル化したEuTR-L1AMを用いて細胞内取り込み量，細胞内保持時間について評価した．ICP原子発光分析を用いて評価したところ，高濃度で細胞内に取り込まれ，一時間以上経過してもセンサーが留ることが明らかとなった．さらに独自に構築したTRイメージングシステムとEuTR－L1AMを用いて細胞内Zn2+イオンシグナルのTRイメージングを行ったところ高いS/N比でのイメージングに成功した．以上の結果から１年目の研究計画は達成できたと言える．