新規プロテオーム解析手法による根粒菌の窒素固定機構の解明とアンモニア生産への応用

利用新的蛋白质组分析方法阐明根瘤菌的固氮机制及其在氨生产中的应用

• 批准号: 14J01156
• 负责人: 立上 陽平
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J01156/
• 关键词: 窒素固定; 根粒菌; 転写因子; ジベレリン; 根粒形成制御; アンモニア; アンモニア生産

①Mesorhizobium lotiの転写因子による人工遺伝子発現制御これまでの研究の成果から、我々はM. lotiの共生状態特異的な転写因子である、nifA2(mlr5837)とrpoN2(mll5872)に着目し、これら二つの転写因子を試験管培養下でも誘導発現させることにより、M. lotiのタンパク質発現が共生状態に近づけた。2つの転写因子を同時にIPTG誘導できるようにするため、lac promoterの下流にこれらの遺伝子を組み込みオペロン化し、その領域を広域宿主プラスミドpLAFR1に組み込んだ。さらに窒素固定タンパク質ニトロゲナーゼの活性中心の合成に必要なホモクエン酸合成のため、ホモクエン酸シンターゼ遺伝子nifVを土壌細菌Azotobacter vinelandiiからクローニングし、相同組換えによりM. lotiへのゲノム挿入を試みた。この状態でニトロゲナーゼの中心酵素NifHが発現することをウェスタンブロッティングにより確認し、さらに、その他の窒素固定関連遺伝子20種類以上が発現していることもプロテオーム解析により確認した。ただし、外的に導入したnifVは発現せず、結果としてニトロゲナーゼ中心錯体が形成されずに根粒菌が窒素固定能を示さなかった。②M. lotiの共生時特異的な植物ホルモンの生産根粒菌のメタボローム解析の結果、根粒菌が植物ホルモンであるジベレリンを合成していることを発見した。加えて、各酵素群の機能解明を行い、合成経路を世界で初めて同定した。さらに、根粒菌のジベレリン合成遺伝子破壊株を用い、植物生理学的な実験を行った結果、根粒菌の合成するジベレリンが宿主植物の根粒数を負に制御することを見出した。現在はさらに解析を進め、根粒菌由来のジベレリンがどのようなシグナル伝達系で植物表現型に影響を与えているかを検証中である。

1）通过先前研究的结果来控制人造基因的表达，我们专注于特定于M. loti共生状态，NIFA2（MLR5837）和RPON2（MLL5872）（MLL5872）的转录因子，并通过在测试管培养物中诱导了这些两个转录因子，诱导了M. lote loTeb oteb ote a prote的表达。为了允许两个转录因子同时诱导IPTG，这些基因被整合到LAC启动子的下游，并将该区域操作到宽光谱宿主质粒PLAFR1中。此外，对于同化酸合酶，这对于合成氮固结蛋白氮酶的活性中心是必不可少的，同构酸合成酸基因NIFV是从土壤细菌Azotobacter Vinelandii和基因组插入M. loti中通过与人体重新构造的M. loti中的。蛋白质印迹证实，在该状态下表达了氮气中心酶NIFH的表达，并且蛋白质组分析还证实，表达了20多个其他与氮固定相关的基因。然而，未表达外部引入的NIFV，导致形成氮酶中心络合物，而根瘤菌没有表现出氮固定能力。 ②产生了针对洛洛蒂共生的植物激素，由于根瘤菌的代谢组分析，发现根瘤菌合成植物激素gibberellin。此外，阐明了每个酶的功能，并在世界上首次确定了合成途径。此外，我们使用根瘤菌的吉布雷素合成基因破坏菌株进行了植物生理实验，发现根瘤菌合成的吉布雷素合成对宿主植物中结节的数量负调节。我们目前正在进行进一步的分析，以检查根瘤菌中哪些信号传导系统gibberellins会影响植物表型。

项目成果

立上陽平・植田充美

立上洋平/上田光美

• 发表时间: 2015
• 作者: Ni;Bin;Yasuyuki Todo;and Tomohiko Inui;バイオ水素とキャリア開発の最前線 3章-7 「微生物の合成生物学的改質育種に向けて」
• 通讯作者: バイオ水素とキャリア開発の最前線 3章-7 「微生物の合成生物学的改質育種に向けて」

Putative Alginate Assimilation Process of the Marine Bacterium Saccharophagus degradans 2-40 Based on Quantitative Proteomic Analysis

• DOI: 10.1007/s10126-015-9667-3
• 发表时间: 2015-10
• 期刊: Marine Biotechnology
• 影响因子: 3
• 作者: T. Takagi;Hironobu Morisaka;Shunsuke Aburaya;Yohei Tatsukami;K. Kuroda;M. Ueda

Quantitative time-course proteome analysis of Mesorhizibium loti during nodule maturation

Mesorhizibium loti 根瘤成熟过程中的定量时程蛋白质组分析

• DOI: 10.1016/j.jprot.2015.04.034
• 发表时间: 2015
• 期刊: Journal of Proteomics
• 影响因子: 3.3
• 作者: Mami Nambu;Yohei Tatsukami;Hironobu Morisaka;Kouichi Kuroda;Mitsuyoshi Ueda
• 通讯作者: Mitsuyoshi Ueda

Qualitative and quantitative proteomics of legume-symbiont Mesorhizobium loti

豆科共生根瘤菌的定性和定量蛋白质组学

• 发表时间: 2015
• 作者: Yohei Tatsukami;Mami Nambu;Hironobu Morisaka;Kouichi Kuroda;Mitsuyoshi Ueda
• 通讯作者: Mitsuyoshi Ueda

根粒菌の生産するジベレリンが根粒数を制御する

根瘤菌产生的赤霉素控制根瘤的数量

• 发表时间: 2016
• 作者: Akira Kawashima;Takayuki Nakanishi;Tamaki Shibayama;Seiichi Watanabe;Koji Fujita; Katsuhisa Tanaka;Hitoshi Koizumi;Koji Fushimi;Yasuchika Hasegawa;渡辺裕美;立上陽平
• 通讯作者: 立上陽平