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細胞内ミトコンドリア輸送システムを利用した核酸送達キャリアの開発

利用细胞内线粒体转运系统开发核酸转运载体

基本信息

批准号：
14J02379
负责人：
河村恵理子
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本申請研究では、変異ミトコンドリアを標的とした治療戦略を確立するため、これまでに構築したミトコンドリア標的型キャリアを用いて、機能性核酸をミトコンドリアに送達し、ミトコンドリアへの核酸送達検証、機能評価を行うことを目的とした。平成28年度は、下記について研究を遂行した。ミトコンドリアDNAの変異・欠損は、ミトコンドリアの機能低下を引き起こし、ミトコンドリア病を誘発する。mtDNAのtRNA（Phe）にG625A変異を有するミトコンドリア病患者由来細胞を用いて、正常なtRNA（Phe）をミトコンドリアに補充する遺伝子治療戦略の検証を行った。はじめに、ミトコンドリアにおけるtRNA（Phe）の変異率をARMS-qPCR法を用いて算出する実験系を確立した。使用したミトコンドリア病患者由来細胞は、正常型mtDNAと変異型mtDNAが混在するヘテロプラスミー変異であり、変異率が８０％程度であることを確認した。正常pre-tRNA（Phe）を搭載したミトコンドリア標的型キャリアをミトコンドリア病患者由来線維芽細胞に添加した結果、コントロール配列では変化がなかったのに対し、ミトコンドリアにおけるtRNA（Phe）の変異率が４０％程度まで低下したことが示唆された。また、ミトコンドリア輸送能をもつRNA配列をpre-tRNA（Phe）に付加することにより、添加後8日目まで変異率が２０％程度まで大きく低下することが示された。一方で、pre-tRNA（Phe）を導入したプラスミドDNAをリポフェクタミンを用いて核で発現させた場合には、変異率の低下がみられなかった。さらに、正常pre-tRNA（Phe）搭載ミトコンドリア標的型キャリアを添加したミトコンドリア病患者由来線維芽細胞では、コントロールと比較してミトコンドリア呼吸能が上昇することが示唆された。

The present application studies the establishment of therapeutic strategies for different types of nucleic acid delivery, functional nucleic acid delivery, and functional evaluation. Heisei 28 years ago, the next record of the research carried out The change of DNA and the loss of DNA The mtDNA G625A variant is used in cell culture of patients with disease, and normal tRNA (Phe) is used in cell culture of patients with disease. The variation rate of tRNA (Phe) was calculated by ARMS-qPCR method. The results showed that the mtDNA heteromorphic rate was 80%. The normal pre-tRNA (Phe) was loaded with the target type of protein, and the protein was added to the cells of the line in the patients with the disease. The protein was arranged in the same way as the target type of protein. The variation rate of the target tRNA (Phe) was 40% lower than that of the control group. 8 days after addition, the variation rate was 20%, and the variation rate was significantly lower than that of pre-tRNA (Phe). A party, pre-tRNA (Phe) is introduced into the DNA, and the rate of variation is low. In addition, normal pre-tRNA (Phe) carries the same type of protein as normal pre-tRNA (Phe), and the same type of protein is added to normal pre-tRNA (Phe).