植物疫病菌の交配ホルモンα１、α２のケミカルバイオロジー

疫病菌Phytophthoraの有性生殖に関するケミカルバイオロジー研究の一環として、当該年度は2つの交配ホルモンα2およびα1の生合成酵素の探索を行い以下の成果を得た。1. α2生合成の最適条件の検討　生合成前駆体であるphytolを含む種々の濃度のV8ジュース培地でP. nicotianaeを振盪培養し、上清中のα2をLC/MSで定量した。その結果、α2は0.1% V8培地で最も産生され、培養2日目から増加し4日目で頭打ちになった。このことから、α2合成酵素の活性（発現量）は貧栄養下ほど高く、培養4日目以降低下することがわかった。2.α2産生アッセイ　0.1% V8培地で2日間培養したP. nicotianaeからタンパク質を抽出し、チトクロムP450の検出に用いられるNADPH、glucose-6-phosphate (G-6-P) およびG-6-P dehydrogenase存在下でphytolを加えてアッセイを行った。反応物中のα2をLC/MSで測定したが、α2への変換は確認されなかった。3. α1生合成の最適条件・菌株の検討　α1産生能が高い（生合成酵素の発現量が多いと思われる）3株を、phytolを添加した20 % V8培地で培養し、α1産生量の経時変化を調べた。その結果、P. cryptogeaの産生量が最も多く、5～6日目に産生量が急増することがわかった。4. α1産生アッセイ　20 % V8液体培地で5日間培養したP. cryptogeaからタンパク質を抽出し、α2アッセイと同条件下、前駆体であるα2を加えてアッセイを行った。α2からα1への変換が確認されたが、その変換効率は0.1 %と生菌による変換と比べて非常に低かった。さらに4 ℃のバッファー中で生菌を弱く潰しても活性が完全に失われたことから、目的とする酵素は非常に不安定と考えられる。

疫病菌Phytophthoraの有性生殖に関するケミカルバイオロジー研究の一環として、当該年度は2つの交配ホルモンα2およびα1の生合成酵素の探索を行い以下の成果を得た。1. α2生合成の最適条件の検討　生合成前駆体であるphytolを含む種々の濃度のV8ジュース培地でP. nicotianaeを振盪培養し、上清中のα2をLC/MSで定量した。その結果、α2は0.1% V8培地で最も産生され、培養2日目から増加し4日目で頭打ちになった。このことから、α2合成酵素の活性（発現量）は貧栄養下ほど高く、培養4日目以降低下することがわかった。2.α2産生アッセイ　0.1% V8培地で2日間培養したP. nicotianaeからタンパク質を抽出し、チトクロムP450の検出に用いられるNADPH、glucose-6-phosphate (G-6-P) およびG-6-P dehydrogenase存在下でphytolを加えてアッセイを行った。反応物中のα2をLC/MSで測定したが、α2への変換は確認されなかった。3. α1生合成の最適条件・菌株の検討　α1産生能が高い（生合成酵素の発現量が多いと思われる）3株を、phytolを添加した20 % V8培地で培養し、α1産生量の経時変化を調べた。その結果、P. cryptogeaの産生量が最も多く、5～6日目に産生量が急増することがわかった。4. α1産生アッセイ　20 % V8液体培地で5日間培養したP. cryptogeaからタンパク質を抽出し、α2アッセイと同条件下、前駆体であるα2を加えてアッセイを行った。α2からα1への変換が確認されたが、その変換効率は0.1 %と生菌による変換と比べて非常に低かった。さらに4 ℃のバッファー中で生菌を弱く潰しても活性が完全に失われたことから、目的とする酵素は非常に不安定と考えられる。