生細胞膜における網羅的脂質ラベル化技術の開発と脂質プロファイリング

开发活细胞膜中的综合脂质标记技术和脂质分析

基本信息

批准号：
14J04745
负责人：
安枝裕貴
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物細胞においてタンパク質の発現はオルガネラ毎に厳密に制御されており、絶えず動的に変化している。これらオルガネラのタンパク質を網羅的に解析する「プロテオミクス」と呼ばれる研究は疾病診断や生命現象の解明において極めて重要である。申請者は博士課程において、有機小分子によるオルガネラ選択的なタンパク質修飾法を開発し、様々な培養細胞のオルガネラ選択的プロテオミクスや生体組織への応用、薬剤刺激に伴う動的なプロテオームの変化の検出を行った。最初にミトコンドリアをターゲットとした局在型反応性小分子ORMs (Organelle-localizable Reactive Molecules)を設計、合成した。蛍光色素であるローダミンを基本骨格としたORMは、培養がん細胞においてミトコンドリアに濃縮されることで様々なタンパク質と反応した。LC-MS解析の結果、多数のミトコンドリアのタンパク質の同定に成功した。また本手法が培養がん細胞だけでなく、神経細胞初代培養系やマウス脳スライス(組織)においても適用可能であることを示した。本手法は、小分子の蛍光によりタンパク質発現の変化を簡便に追跡可能であり、細胞分化における動的なミトコンドリアタンパク質の発現量変化の可視化にも成功した。またSILACと呼ばれる定量プロテオミクス手法を組み合わせることにより、細胞内の活性酸素(ROS)産生にともなうタンパク質発現の変化を網羅的かつ定量的に解析することにも成功した。

在真核细胞中，蛋白质表达严格从细胞器到细胞器控制，并不断动态变化。研究称“蛋白质组学”，对这些细胞器的蛋白质进行了全面分析，在疾病诊断和阐明生命现象中极为重要。在博士课程中，申请人使用小有机分子开发了一种细胞器选择蛋白修饰方法，并在各种培养的细胞中使用了细胞器选择性蛋白质组学，并检测到与药物刺激相关的动态蛋白质组变化。首先，设计并合成了针对线粒体的局部反应性小分子（可钙化反应性分子）。基于荧光染料若丹明的ORMS作为碱基链链浓缩在培养的癌细胞中，并与各种蛋白质反应。 LC-MS分析表明，成功鉴定出许多线粒体蛋白。还已经表明，该技术不仅可以应用于培养的癌细胞，还可以应用于原发性神经元培养系统和小鼠脑切片（组织）。该方法可以轻松跟踪由于小分子的荧光而引起的蛋白质表达的变化，并且还成功地可视化了细胞分化过程中线粒体蛋白表达水平的动态变化。此外，通过结合一种称为SILAC的定量蛋白质组学技术，我们成功地完成了与细胞内活性氧（ROS）产生相关的蛋白质表达变化的全面和定量分析。