医薬価値に優れた骨形成促進人工ペプチドの創製とその骨代謝疾患治療への展開

前年度に、TNFαとRANKLに対して、数億種類もの多様性を有するファージペプチドライブラリを構築し、その濃縮方法や検出方法を設定した。当該年度は、TNFαやRANKLの受容体領域を模倣したペプチド（W9、OP3-4）を鋳型とし、これらと比較して結合力の向上した候補クローン探索した。W9、OP3-4を鋳型としたペプチドライブラリ提示ファージを約2.0 x 10 13 cfuずつ混合したライブラリを用いた。ファージは、非特異的な結合を示すことが多いため、タンパク質非固相化チューブを用いネガティブセレクションを行った。次に、その上清液を、ビオチン化TNFα、RANKL（100 pmol）を予めビーズにコーティングしたチューブに加え、結合させた。その後、ビーズに結合しないファージを洗浄し、結合ファージを回収する操作を繰り返し、TNFα、RANKLと結合するペプチド提示ファージを濃縮した。鋳型ペプチドと比べ結合力の増強したペプチド提示ファージを絞り込むために、培養上清中のファージを用いELISAを行った。その結果、鋳型ペプチドと比較し結合力が増強したと考えられるペプチド提示ファージを各々8種類同定した。本結果は、ファージ産生量が個々のサンプルにより異なる可能性が考えられたため、次に、絞り込んだクローンのファージ量を揃えELISAを行った。各ファージを精製し1x10 10 cfuに合わせ、TNFα、RANKL固相化プレート、および非特異的な結合を評価する目的でherceptin固相化プレートを用いた。その結果、herceptinと結合せず、鋳型ペプチドと比べ結合性が向上した候補ペプチド提示ファージを数種類同定した。また、その結合性の上昇効率は、最も高いもので約10倍であった。以上、本申請研究では、鋳型ペプチドと比較しTNFαやRANKLに対する結合性が向上した候補クローンを同定すると共に、低親和性であるペプチドを提示したファージライブラリから高親和性の候補クローンを探索するための基盤情報を収集した。

前年度に、TNFαとRANKLに対して、数億種類もの多様性を有するファージペプチドライブラリを構築し、その濃縮方法や検出方法を設定した。当該年度は、TNFαやRANKLの受容体領域を模倣したペプチド（W9、OP3-4）を鋳型とし、これらと比較して結合力の向上した候補クローン探索した。W9、OP3-4を鋳型としたペプチドライブラリ提示ファージを約2.0 x 10 13 cfuずつ混合したライブラリを用いた。ファージは、非特異的な結合を示すことが多いため、タンパク質非固相化チューブを用いネガティブセレクションを行った。次に、その上清液を、ビオチン化TNFα、RANKL（100 pmol）を予めビーズにコーティングしたチューブに加え、結合させた。その後、ビーズに結合しないファージを洗浄し、結合ファージを回収する操作を繰り返し、TNFα、RANKLと結合するペプチド提示ファージを濃縮した。鋳型ペプチドと比べ結合力の増強したペプチド提示ファージを絞り込むために、培養上清中のファージを用いELISAを行った。その結果、鋳型ペプチドと比較し結合力が増強したと考えられるペプチド提示ファージを各々8種類同定した。本結果は、ファージ産生量が個々のサンプルにより異なる可能性が考えられたため、次に、絞り込んだクローンのファージ量を揃えELISAを行った。各ファージを精製し1x10 10 cfuに合わせ、TNFα、RANKL固相化プレート、および非特異的な結合を評価する目的でherceptin固相化プレートを用いた。その結果、herceptinと結合せず、鋳型ペプチドと比べ結合性が向上した候補ペプチド提示ファージを数種類同定した。また、その結合性の上昇効率は、最も高いもので約10倍であった。以上、本申請研究では、鋳型ペプチドと比較しTNFαやRANKLに対する結合性が向上した候補クローンを同定すると共に、低親和性であるペプチドを提示したファージライブラリから高親和性の候補クローンを探索するための基盤情報を収集した。