医薬価値に優れた骨形成促進人工ペプチドの創製とその骨代謝疾患治療への展開

具有优良药用价值的促骨人工肽的创制及其在骨代谢疾病治疗中的应用

• 批准号: 14J04929
• 负责人: 永野 貴士
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J04929/
• 关键词: 骨再生ペプチド; ファージ表面提示法; RANKL

前年度に、TNFαとRANKLに対して、数億種類もの多様性を有するファージペプチドライブラリを構築し、その濃縮方法や検出方法を設定した。当該年度は、TNFαやRANKLの受容体領域を模倣したペプチド（W9、OP3-4）を鋳型とし、これらと比較して結合力の向上した候補クローン探索した。W9、OP3-4を鋳型としたペプチドライブラリ提示ファージを約2.0 x 10 13 cfuずつ混合したライブラリを用いた。ファージは、非特異的な結合を示すことが多いため、タンパク質非固相化チューブを用いネガティブセレクションを行った。次に、その上清液を、ビオチン化TNFα、RANKL（100 pmol）を予めビーズにコーティングしたチューブに加え、結合させた。その後、ビーズに結合しないファージを洗浄し、結合ファージを回収する操作を繰り返し、TNFα、RANKLと結合するペプチド提示ファージを濃縮した。鋳型ペプチドと比べ結合力の増強したペプチド提示ファージを絞り込むために、培養上清中のファージを用いELISAを行った。その結果、鋳型ペプチドと比較し結合力が増強したと考えられるペプチド提示ファージを各々8種類同定した。本結果は、ファージ産生量が個々のサンプルにより異なる可能性が考えられたため、次に、絞り込んだクローンのファージ量を揃えELISAを行った。各ファージを精製し1x10 10 cfuに合わせ、TNFα、RANKL固相化プレート、および非特異的な結合を評価する目的でherceptin固相化プレートを用いた。その結果、herceptinと結合せず、鋳型ペプチドと比べ結合性が向上した候補ペプチド提示ファージを数種類同定した。また、その結合性の上昇効率は、最も高いもので約10倍であった。以上、本申請研究では、鋳型ペプチドと比較しTNFαやRANKLに対する結合性が向上した候補クローンを同定すると共に、低親和性であるペプチドを提示したファージライブラリから高親和性の候補クローンを探索するための基盤情報を収集した。

In the past year, TNFα and RANKL have been selected for the diversity of their products. When this year, TNFα and RANKL receptor domain are simulated (W9, OP3 -4), the combination of these two forces is explored. W9, OP3-4 are the most common types of hybrid devices. They can be used in combination with 2.0 x 10 13 cfu. The combination of non-specific and non-specific proteins can be used in the treatment of chronic diseases. The next step is to increase the concentration of TNFα and RANKL (100 pmol). After the meeting, the two sides agreed to discuss ways to improve the bilateral relations. The results showed that the binding ability of the two proteins increased significantly. The results of the study showed that the binding force of the two groups increased. The results showed that the amount of protein produced by the enzyme was different from that of the control group. For the purpose of purification, 1 x 10 cfu of TNFα and RANKL were used. The result is that the herceptin and the combination of the two types are the same. The rate of increase of the binding property is about 10 times that of the highest one. In the above study, the combination of TNFα and RANKL was improved, and the candidate with low affinity was improved.