オプトジェネティクス技術を用いた反芻家畜における卵胞発育制御メカニズムの解明

本研究は「視床下部弓状核KNDyニューロンが卵胞発育を促す性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）パルスの発生中枢である」ことを直接的に証明することを目的とし、神経活動を人為的に制御可能な光感受性イオンチャネルをKNDyニューロン特異的に発現させたシバヤギの作出を目指した。このヤギの作出には、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターをもちいた遺伝子導入技術とCre recombinase（Cre）を用いた部位特異的な遺伝子組換え技術を組み合わせた。今年度は、シバヤギ弓状核へのAAV注入により、KNDyニューロンでCre発現に依存したタンパク質発現を誘導できるかを評価した。今回の評価では、以下の各々のDNAコンストラクトを含む2種類のAAVを生成した。（１）Cre依存的に発現する赤色蛍光タンパク質（mCherry）のDNAコンストラクト（２）KNDyニューロン特異的にCre発現を誘起するDNAコンストラクト精巣除去成熟雄シバヤギの弓状核に上記の2種類のAAVを注入し、3週間以上飼育した。その後、脳組織を灌流固定し、弓状核を含む脳ブロックを切り出して、凍結切片を作製した。その結果、AAV注入に用いたインジェクターは弓状核ないし弓状核周辺領域に位置しており、インジェクター痕周辺で赤色蛍光が観察された。今後は、切片上で観察された赤色蛍光がmCherryタンパク質由来であるかを確認する必要がある。さらに、KNDyニューロン内の神経ペプチドとmCherryタンパク質の二重染色により、Cre依存的にかつKNDyニューロン特異的にmCherryが発現可能であるかを精査する必要がある。目的のシバヤギ作出後は、KNDyニューロンの人為的操作に対応して、弓状核の神経活動やGnRH/LH分泌が変化するかを解析可能となると考えている。

本研究は「視床下部弓状核KNDyニューロンが卵胞発育を促す性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）パルスの発生中枢である」ことを直接的に証明することを目的とし、神経活動を人為的に制御可能な光感受性イオンチャネルをKNDyニューロン特異的に発現させたシバヤギの作出を目指した。このヤギの作出には、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターをもちいた遺伝子導入技術とCre recombinase（Cre）を用いた部位特異的な遺伝子組換え技術を組み合わせた。今年度は、シバヤギ弓状核へのAAV注入により、KNDyニューロンでCre発現に依存したタンパク質発現を誘導できるかを評価した。今回の評価では、以下の各々のDNAコンストラクトを含む2種類のAAVを生成した。（１）Cre依存的に発現する赤色蛍光タンパク質（mCherry）のDNAコンストラクト（２）KNDyニューロン特異的にCre発現を誘起するDNAコンストラクト精巣除去成熟雄シバヤギの弓状核に上記の2種類のAAVを注入し、3週間以上飼育した。その後、脳組織を灌流固定し、弓状核を含む脳ブロックを切り出して、凍結切片を作製した。その結果、AAV注入に用いたインジェクターは弓状核ないし弓状核周辺領域に位置しており、インジェクター痕周辺で赤色蛍光が観察された。今後は、切片上で観察された赤色蛍光がmCherryタンパク質由来であるかを確認する必要がある。さらに、KNDyニューロン内の神経ペプチドとmCherryタンパク質の二重染色により、Cre依存的にかつKNDyニューロン特異的にmCherryが発現可能であるかを精査する必要がある。目的のシバヤギ作出後は、KNDyニューロンの人為的操作に対応して、弓状核の神経活動やGnRH/LH分泌が変化するかを解析可能となると考えている。