オートファジーによる老化・寿命延長の臓器間制御機構の解明

オートファジーを誘導するTat-beclin 1ペプチドの改変タンパク質の遺伝子をpTRE-tightベクターに組み込み、オートファゴソームのマーカータンパク質をコードするpeGFP-LC3プラスミドとMCF-7細胞にコトランスフェクションした。Dox存在下で改変タンパク質の発現を誘導したとこと、改変タンパク質の発現をウエスタンブロットで確認することができた。この細胞を顕微鏡観察をしたところ、Dox存在下ではDox非存在下に比べ２倍以上オートフゴソームが形成されている事を見いだした。これらの事は、Doxで発現誘導されたTat-beclin 1改変タンパク質が細胞でオートファジーを亢進できる事を示していた。そこで、pTRE-tightプラスミドに組み込まれたTat-beclin 1改変タンパク質の遺伝子を当研究センターの動物実験施設の協力でB6マウスに組み込み、トランスジェニックマウスの作製を行った。改変タンパク質の遺伝子が組み込まれたかスクリーニンングを行ったところ、目的の遺伝子が組み込まれたマウス４匹得る事ができた。これら４匹のマウスを、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/Jと掛け合わせ、生まれてきたマウスが8週齢になってから、マウスの飲み水にDoxを添加した。Dox入り飲料水を１週間飲ませた後、肝臓、小腸、胃、骨髄および骨髄由来マクロファージを採取し、ウェスタンブロットでTat-beclin 1改変タンパク質の検出を行った。４匹のトランスジェニックマウスのうち３匹の解析を終えたが、1匹目のマウスは小腸と骨髄由来マクロファージで改変タンパク質を検出する事ができた。2匹目のマウスでは、小腸および他の臓器においても改変タンパク質の発現を検出する事ができた。3匹目のマウスでは解析した臓器において改変タンパク質の発現を検出する事ができなかった。

オートファジーを誘導するTat-beclin 1ペプチドの改変タンパク質の遺伝子をpTRE-tightベクターに組み込み、オートファゴソームのマーカータンパク質をコードするpeGFP-LC3プラスミドとMCF-7細胞にコトランスフェクションした。Dox存在下で改変タンパク質の発現を誘導したとこと、改変タンパク質の発現をウエスタンブロットで確認することができた。この細胞を顕微鏡観察をしたところ、Dox存在下ではDox非存在下に比べ２倍以上オートフゴソームが形成されている事を見いだした。これらの事は、Doxで発現誘導されたTat-beclin 1改変タンパク質が細胞でオートファジーを亢進できる事を示していた。そこで、pTRE-tightプラスミドに組み込まれたTat-beclin 1改変タンパク質の遺伝子を当研究センターの動物実験施設の協力でB6マウスに組み込み、トランスジェニックマウスの作製を行った。改変タンパク質の遺伝子が組み込まれたかスクリーニンングを行ったところ、目的の遺伝子が組み込まれたマウス４匹得る事ができた。これら４匹のマウスを、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/Jと掛け合わせ、生まれてきたマウスが8週齢になってから、マウスの飲み水にDoxを添加した。Dox入り飲料水を１週間飲ませた後、肝臓、小腸、胃、骨髄および骨髄由来マクロファージを採取し、ウェスタンブロットでTat-beclin 1改変タンパク質の検出を行った。４匹のトランスジェニックマウスのうち３匹の解析を終えたが、1匹目のマウスは小腸と骨髄由来マクロファージで改変タンパク質を検出する事ができた。2匹目のマウスでは、小腸および他の臓器においても改変タンパク質の発現を検出する事ができた。3匹目のマウスでは解析した臓器において改変タンパク質の発現を検出する事ができなかった。