Foamy Virus Replication: Structure-function analysis of viral enzymes involved in generating genetic diversity or in conserving the genome

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Foamy Viren (FV) oder Spumaviren gehören zur Familie der Retroviridae, jedoch unterscheidet sich ihre Replikationsstrategie von anderen Retroviren. So wird z.B. das Pol-Vorläuferprotein separat vom Kapsidprotein exprimiert und nicht vollständig gespalten. Reverse Transkription tritt spät im Lebenszyklus auf, wodurch Viruspartikel entstehen, die DNA beinhalten. Aufgrund der ungewöhnlichen FV Replikation und Struktur der Reversen Transkriptase (RT) wollen wir die Protease-RT (PR-RT) des Simian Foamy Virus 1 (SFV-1) und ein gegenüber dem Nukleosidinhibitor AZT resistentes Derivat analysieren, um Aufschluß über den Replikationsmechanismus und die Grundlagen der AZT-Resistenz zu erhalten. Nach rekombinanter Expression und Reinigung sollen biochemische (Analyse der Polymerisations- und RNase H-Aktivitäten, insbesondere die Untersuchung der Prozessivität und der Fehlerrate bei der Polymerisation) und strukturelle Untersuchungen (CD, NMR) mit dem Wildtyp-Enzym und der Resistenzmutante durchgeführt werden. RT und PR müssen offenbar fusioniert sein, um aktiv zu sein. C-terminale Deletionen am PR-RT Protein sollen darüber Aufschluß geben, wie groß der RT-Anteil für die Aktivität der PR-Domäne sein muß. Darüber hinaus werden C-terminale Deletionsmutanten für NMR-spektroskopische Untersuchungen verwendet. Durch Inteinfusionen mit PR und RT können spezifisch nur in der PR-Domäne mit 15N markierte PR-RT Proteine hergestellt werden, die es erlauben, die PR im Kontext der gesamten PR-RT NMR-spektroskopisch zu untersuchen. Da sich in verwandten Systemen gezeigt hat, daß in vitro Daten nicht unbedingt das in vivo Verhalten widerspiegeln, wird komplementär zu den oben skizzierten Experimenten ein System etabliert, mit dem sich die in vivo Mutationsrate von FV untersuchen läßt.