超高感度な固体ＮＭＲを用いた細胞内タンパク質運動性測定法の開発と応用

本研究では、細胞内(in-cell)固体NMRを用いた細胞内分子数の定量、細胞内分子の超高感度測定に向けた高温動的核分極法(高温DNP)のためのガラス基質の探索、細胞内タンパク質の構造情報を得るための新規ラジカルタグの合成を行った。細胞内分子数の定量研究では、昨年度に大腸菌細胞を生きたまま固体NMRを用いて測定し、ユビキチン過剰発現時の1細胞あたりに合成される分子種・分子数を定量する方法論を確立した。今年度はさらにその手法を発展させ、大腸菌細胞内でのユビキチン構造解析を行った。その結果、大腸菌細胞内のユビキチンは、正しい二次構造を取っていることが示された。高温DNPのガラスマトリクス探索では、昨年度の探索によりリボース、イジトール、ソルビトールが適することを見出していたが、高濃度ソルビトール溶液は室温で放置すると結晶化してしまい、不適であることが分かった。また、DSCを用いてリボース、イジトールのガラスマトリクスのガラス転移点を測定し、210 K以上になったことを確認した。これらのマトリクスを用いれば、210 K以上での測定が必要なタンパク質の運動性に関する情報を、高感度で得られるようになる。新規ラジカルタグの合成研究では、光励起ラジカルであるフラビンによる核スピン緩和促進効果により、タンパク質内の原子間距離を求める手法開発を試みた。昨年度合成したタグ化フラビン分子は水中で不安定であり、タンパク質のタグ化には不適であった。そこで、新たな分子を複数設計し、種々の条件で合成を試みたところ、条件に合うタグ化フラビン分子を1種合成することに成功した。

本研究では、細胞内(in-cell)固体NMRを用いた細胞内分子数の定量、細胞内分子の超高感度測定に向けた高温動的核分極法(高温DNP)のためのガラス基質の探索、細胞内タンパク質の構造情報を得るための新規ラジカルタグの合成を行った。細胞内分子数の定量研究では、昨年度に大腸菌細胞を生きたまま固体NMRを用いて測定し、ユビキチン過剰発現時の1細胞あたりに合成される分子種・分子数を定量する方法論を確立した。今年度はさらにその手法を発展させ、大腸菌細胞内でのユビキチン構造解析を行った。その結果、大腸菌細胞内のユビキチンは、正しい二次構造を取っていることが示された。高温DNPのガラスマトリクス探索では、昨年度の探索によりリボース、イジトール、ソルビトールが適することを見出していたが、高濃度ソルビトール溶液は室温で放置すると結晶化してしまい、不適であることが分かった。また、DSCを用いてリボース、イジトールのガラスマトリクスのガラス転移点を測定し、210 K以上になったことを確認した。これらのマトリクスを用いれば、210 K以上での測定が必要なタンパク質の運動性に関する情報を、高感度で得られるようになる。新規ラジカルタグの合成研究では、光励起ラジカルであるフラビンによる核スピン緩和促進効果により、タンパク質内の原子間距離を求める手法開発を試みた。昨年度合成したタグ化フラビン分子は水中で不安定であり、タンパク質のタグ化には不適であった。そこで、新たな分子を複数設計し、種々の条件で合成を試みたところ、条件に合うタグ化フラビン分子を1種合成することに成功した。