水田土壌の水素生成・消費微生物群集に関する生態学的研究

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水田土壌における嫌気還元環境の形成や有機物分解過程に重要な役割を果たすと考えら、系統学的・生理的に多様な水素代謝微生物群集の多様性の評価を目指して研究を行った。１．水素消費微生物を対象とした分子生物学的解析手法の確立：水素代謝酵素であるヒドロゲナーゼのうち、[NiFe]-ヒドロゲナーゼに関連する酵素をコードする遺伝子hypDを対象としたPCR法の検討とシーケンス解析を行った。Beimgrabenら（2014)の報告したプライマーセットを用いて水田土壌およびメタン生成古細菌ゲノムDNAからのPCRを試みたところ、目的断片長の増幅産物を得たため、精製後にシーケンス解析を行った。メタン生成古細菌ゲノムDNAについてはデータベース上のメタン生成古細菌のhypDと高い相同性を有していたほか、水田土壌DNAについてはクローンライブラリーを構築後に解析を行いChloroflexiやActinobacteriaなどのhypDと高い相同性を有する19配列が得られた。２．稲わらからの細菌細胞回収およびin situ PCR-フローサイトメーターを併用した細胞体分取法の確立：Ikeda et al. (2009)を参考として、水田土壌に埋設・培養した稲わらからの細菌細胞回収を行い、およそ107 個の細胞および粒子を回収した。また、特定のhydA断片をプラスミドに有するE. coliを用いてin situ PCRによる特定のhydAの増幅と細菌体の標識を試みたが、蛍光標識したPCR産物が固定した細菌細胞内に保持されず、標識は困難だった。そこで、等温での遺伝子増幅反応を特徴とするLAMP法による標識手法の確立を試み、特定のhydAを対象としたプライマーセットを専用ソフトウェアで設計し、それらを利用した等温反応による増幅産物を得ることができた。