実験室進化実験による３－ヒドロキシプロピオン酸高生産大腸菌の合理的育種

通过实验室进化实验合理选育高产3-羟基丙酸大肠杆菌

• 批准号: 15J06350
• 负责人: 徳山 健斗
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J06350/
• 关键词: 進化工学; ゲノムスケールモデル; 物質生産; ゲノム変異解析

微生物の代謝を利用した生産プロセスは、環境への負荷が少なく持続的な生産を可能とするプロセスとして期待されている。代謝による物質生産を高度化するには、代謝全体を目的物質生産に適した状態へと改変する必要がある。生物は、元来置かれた環境に適応し、細胞内の代謝状態を自然に最適化するという性質を有しており、この特徴を代謝改変に利用できないかと考えた。実験室進化実験は、同一培養環境下で継代培養することで増殖速度が向上するよう株を育種する手法である。細胞が増殖すればするほど目的物質を生産する増殖連動型の生産株に実験室進化実験を行えば、生産性向上が期待できる。本研究では、計算機上で再構築されたゲノムスケールの代謝反応モデルを用いて増殖連動型の有用物質生産大腸菌を構築し、さらに実験室進化実験により適応進化させることで高生産株育種を目指す。さらに生産株のオミクス解析を行い、生産性向上に寄与した代謝変動を解明する。本年度は、前年度に同定したコハク酸生産に有効な新規のppc遺伝子変異について解析を行い、生産向上機構を解明した。その結果として、ppcに変異が生じることでアスパラギン酸によるPpcへの阻害を回避し、還元的TCA回路を介したコハク酸生産を向上した事が明らかになった。さらに、代謝反応モデル上のPpcのフラックス値に制約を課した上でシミュレーションを行うことで、増殖連動型のコハク酸生産では、Ppcが律速となる事を数理モデルからも明らかになった。総括として、本研究では代謝反応モデルによる増殖連動型生産に有効な代謝設計と実験室進化による細胞増殖能の向上を行う事で、生物自身に代謝機能を改善させ、コハク酸高生産株を狙い通りに育種する事に成功した。さらに、実験的手法と数理モデルより、増殖連動型のコハク酸生産における律速反応と分子機構を解明し、かつ律速解消に有効な新規の遺伝子変異体の獲得に成功した。

利用微生物代谢的生产过程预计将是一个允许持续生产的过程，而环境影响很小。为了通过新陈代谢改善物质的产生，有必要将整个新陈代谢修改为适合于靶物质生产的状态。生物具有适应其原始环境并自然优化细胞内代谢状态的特性，我们认为此功能可用于代谢修饰。实验室进化实验是繁殖菌株的方法，因此可以通过在同一文化环境中对其进行培养来提高增长率。通过对产生目标物质的增殖相关生产菌株进行实验室进化实验，可以预期生产力。在这项研究中，我们使用计算机重建的基因组尺度代谢反应模型构建了大肠杆菌，这是一种有用的物质生产大肠杆菌，旨在通过通过实验室进化实验来自适应演化来繁殖高产生菌株。此外，将对产生的菌株进行OMICS分析，以阐明有助于提高生产率的代谢波动。今年，我们分析了对琥珀酸酯生产有效的新PPC基因突变，这些突变已在上一年确定，并阐明了生产改进机制。结果，据揭示了PPPC中的突变避免了天冬氨酸对PPC的抑制作用，并通过还原性TCA循环改善了琥珀酸酯的产生。此外，通过模拟PPC在代谢反应模型上的通量值，已经从数学模型中揭示了PPC在增殖链接的琥珀酸产生中是限制速率的。总而言之，这项研究能够通过有效地通过实验室进化来提高生长产生和改善细胞增殖能力的代谢反应模型来改善生物体本身的代谢功能，并成功地育种了该生物体的高核酸产生菌株。此外，已经使用实验方法和数学模型来阐明增殖与琥珀酸产生的速率限制反应和分子机制，并获取有效限制速率的新型基因突变体。

项目成果

グリセロールからのコハク酸生産に向けたin silico代謝設計と実験評価

甘油生产琥珀酸的计算机模拟代谢设计和实验评估

• 发表时间: 2016
• 作者: 徳山 健斗;戸谷 吉博;清水 浩
• 通讯作者: 清水 浩

In silico design and laboratory evolution of Escherichia coli for succinate production

用于琥珀酸生产的大肠杆菌的计算机设计和实验室进化

• 发表时间: 2016
• 作者: Kento Tokuyama;Yoshihiro Toya;Takaaki Horinouchi;Chikara Furusawa;Hiroshi Shimizu
• 通讯作者: Hiroshi Shimizu

Expanding the space of actual metabolic network for growth-coupled succinate production in Escherichia coli by adaptive laboratory evolution

通过适应性实验室进化扩大大肠杆菌生长耦合琥珀酸生产的实际代谢网络空间

• 发表时间: 2017
• 作者: Kento Tokuyama;Yoshihiro Toya;Takaaki Horinouchi;Chikara Furusawa;Hiroshi Shimizu
• 通讯作者: Hiroshi Shimizu

任意の栄養要求生変異株構築に向けた代謝シミュレーション法の開発

构建任意营养缺陷型突变株的代谢模拟方法的开发

• 发表时间: 2017
• 作者: 徳山 健斗;戸谷 吉博;松田 史生;清水 浩
• 通讯作者: 清水 浩

代謝シミュレーションに基づいた有用発酵微生物の育種

基于代谢模拟的有用发酵微生物选育

• 发表时间: 2017
• 作者: 徳山 健斗;戸谷 吉博;松田 史生;清水 浩
• 通讯作者: 清水 浩