High performance microbial cell factories development by model based metabolic design and adaptive laboratory evolution

通过基于模型的代谢设计和适应性实验室进化开发高性能微生物细胞工厂

• 批准号: 19H05626
• 负责人: 清水 浩
• 金额: $ 119.97万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-06-26 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H05626/
• 关键词: 代謝工学; ゲノムスケールモデル; 指向性進化; ロボット; マイクロリアクタ

微生物は細胞内に複雑に相互作用する多数の代謝反応を持つため、目的物質生産のために代謝を最適化するのは容易なことではない。本研究では、微生物代謝を統一的に理解し、合理的にデザインできる代謝工学を確立することを目的としている。有用物質生産の宿主微生物である大腸菌について、様々な炭素源、異なる前駆体から合成される目的物質を設定することで、代謝経路の律速点を網羅的に抽出するための研究を行う。中枢代謝の主要な経路のフラックスを増加するための原理を抽出し、代謝を自在に操る手法を確立することを目指す。すなわち、ゲノムスケールモデルを用い、細胞増殖と目的物質の生産が連動するように代謝経路をデザインする。また、ロボットを用いて継代培養を行い、増殖速度が上昇し代謝の律速点が解消された進化株を取得する。さらに、マイクロ流路を用いたシングルコロニー培養・選択系、多系列連続培養系を開発し、系列数と選択圧の種類を増やすことで、微生物の進化プロセスを多次元化する。得られた進化株のゲノム解析や代謝解析を行い、親株からどのように代謝が遷移したのかを明らかにする。得られた知見をもとに代謝を自在に変化させ、有用物質生産株を構築する手法を確立する。本年度は、代謝モデルを利用し、目的物質を生産する大腸菌の代謝経路のin silicoデザインを行い、生産可能な物質を拡充した。また、細胞増殖と目的物質の生産が連動する代謝をデザインのみならず増殖に非連動な物質生産デザインも可能とする方法を開発し有効性を実証した。さらに、非酸化的解糖経路の導入を行い大腸菌が元来有する経路の理論最大収率を超える生産に成功した。ロボットを用いて、実験室進化とゲノム解析を行って進化と表現型の変化の関係を明らかにした。また、上記の培養・選択系の開発を完成させ，それを用いた実験室進化実験を開始した。

微生物具有许多新陈代谢反应，这些反应在细胞内相互作用，因此优化代谢对靶物质的生产并不容易。这项研究旨在建立代谢工程，从而允许对微生物代谢和合理设计的统一理解。将进行研究，以全面地提取从各种碳源合成的靶物质和大肠杆菌的不同前体（一种产生有用物质）生产它们的宿主微生物，以全面提取代谢途径的速率限制点。我们旨在提取增加主要中央代谢途径通量的原则，并建立自由操纵代谢的方法。也就是说，基因组量表模型用于设计代谢途径，以便将细胞增殖和靶物质的产生联系起来。另外，将细胞使用机器人进行亚培养，以获得进化的菌株，其生长速率增加，而代谢率限制点得到解决。此外，开发了使用微通道和多系列连续培养系统的单个菌落培养和选择系统，并且通过增加串联的数量和选择性压力的类型，微生物的进化过程将是多维的。对产生的进化菌株进行的基因组和代谢分析是为了揭示代谢如何从母体菌株过渡。根据获得的知识，我们将建立一种自由改变代谢和构建有用物质产生菌株的方法。今年，我们使用了代谢模型来设计产生靶物质的大肠杆菌的代谢途径，并扩大了可以生产的物质的数量。我们还开发了一种方法，该方法不仅允许设计新陈代谢，在该代谢中可以将细胞增殖和靶物质的产生连接起来，还可以设计与增殖无关的物质生产，并证明其有效性。此外，已经成功地引入了非氧化糖酵解途径的引入，以产生超过大肠杆菌中最初发现的途径的理论最大值的途径。使用机器人，进行了实验室进化和基因组分析，以阐明进化与表型变化之间的关系。此外，上述培养和选择系统的发展完成了，并开始使用实验​​室进化实验。

项目成果

Analysis of Bacterial Laboratory Evolution toward Prediction, Control, and Macroscopic State Theory of Evolution

细菌实验室进化向预测、控制和宏观进化状态理论的分析

• DOI: 10.2142/biophys.59.262
• 发表时间: 2019
• 期刊: Seibutsu Butsuri
• 作者: FURUSAWA Chikara;HORINOUCHI Takaaki
• 通讯作者: HORINOUCHI Takaaki

代謝モデルを利用した指向性進化による大腸菌イソプレノール合成のボトルネック解消

使用代谢模型通过定向进化消除大肠杆菌异戊二烯醇合成的瓶颈

• 发表时间: 2020
• 作者: 川井隆太郎;三吉健太;堀之内貴明;前田智也;古澤力;戸谷吉博;清水浩
• 通讯作者: 清水浩

相利共生関係を利用した増殖連動型の有用物質生産株の代謝設計

利用互惠关系生产有用物质的生长相关菌株的代谢设计

• 发表时间: 2020
• 作者: 川井隆太郎;戸谷吉博;清水浩
• 通讯作者: 清水浩

大腸菌の共培養によるイソプレノール合成経路のボトルネックの解消

通过共培养大肠杆菌解决异戊二烯醇合成途径的瓶颈

• 发表时间: 2019
• 作者: 川井隆太郎;戸谷吉博;清水浩
• 通讯作者: 清水浩

マイクロドロップレットを用いた大腸菌指向進化実験のとりく み

使用微滴的大肠杆菌定向进化实验

• 发表时间: 2022
• 作者: 佐藤玲子;大竹理寛;高昱偲;戸谷吉博;清水浩;鈴木宏明
• 通讯作者: 鈴木宏明