内在性ｔｕｂｕｌｉｎの特異的ラベル化による微小管ダイナミクス解析

通过内源性微管蛋白的特异性标记分析微管动力学

• 批准号: 15J07815
• 负责人: 宋 智凝
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J07815/
• 关键词: 新しい触媒ラベル化法; Pyridine-oxime触媒; 組織蛋白質ラベル化; 新しい蛋白質ラベル化法; 新触媒反応ラベル化法; 精製蛋白質の特異的ラベル化

これまでに検討してきた「アフィニティ駆動型アシル転移反応法」（AGD）化学ではAcyl Donorとして使われているチオエステルの反応性が高く、触媒なしでも非特異が多く発生し、細胞内など複雑な環境ではつかえない。チオエステルの脱離基のpKaを調整することにより、その反応性を制御することに成功したが、反応性を落としたチオエステルAcyl DonorはDMAPによる活性化が低くまたは無くなる。そのため、現段階では細胞環境ではFKBP12しかラベル化ができない。以上の問題点を解決するためには、pH中性領域でより求核性の高い触媒とより求電子性の低いAcyl Donorの探索が必要である。中性領域で高い求核性を持つPyridine-oxime(Py-oxime)を触媒として見出し、Acyl Donorとして求電子性を落とし、且エステラーゼに耐性を持つN-alkyl-N-acyl sulfonamide(NASA)をみいだした。このPy-oxime触媒とNASA型Acyl Donorの組み合わせで新しいタンパク質ラベル化法を開発した。新たに開発したこのoxime化学は従来のAGD化学と比べ、pH中性領域でのラベル化反応が向上した。細胞ライセートや細胞表層のような夾雑系でのラベル化では、標的タンパク質への高反応効率を保つうえ、標的以外のタンパク質の非特異ラベル化を抑えることができた。選択性、ラベル化効率が向上したことにより、内在性細胞表層膜タンパク質の流動性の算出に成功した。最後に、oxime触媒を二つつけることにより、さらなるラベル化効率の向上を見出し、マウス海馬、小脳スライスのAMPA受容体の特異なラベル化に成功した！AGD化学で達成できなかった組織上の特異的なラベル化に成功した。

This is the first time that a chemical agent has been used in a chemical process, such as "AGD"(Active Gases and Gases). The chemical agent is highly reactive, catalytic, and nonspecific. The pKa of the separation group was successfully controlled. FKBP12 is the cell environment of the present stage. To solve these problems, it is necessary to explore the high-level catalyst of nuclear property and the low-level Acyl Donor of electronic property. Neutral domain is high in nuclear properties, Pyridine-oxide (Py-oxide) is catalyst, Acyl Donor is electronic, and N-alkyl-N-acyl sulfonamide(NASA) is high in resistance. A new method for the synthesis of these Py-oxide catalysts and NASA-type Acyl Donors has been developed. New developments in the field of oxidation chemistry, pH neutrality, and chemical reactions The cell surface layer is composed of a layer of cells, and a layer of cells. The fluidity of the surface layer membrane of the intrinsic cell was successfully calculated. Finally, the specific transformation of AMPA receptor with the two kinds of catalyst is successful. AGD chemistry is successful in achieving specific results on tissues.