ゼニゴケｍｉｃｒｏＲＮＡの欠失変異体の作出および形態制御メカニズムの解明

地钱microRNA缺失突变体的创建及形态控制机制的阐明

• 批准号: 15J08774
• 负责人: 都筑 正行
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J08774/
• 关键词: microRNA; ゼニゴケ; 発生

平成28年度は、前年度作出したゼニゴケmicroRNA（miRNA）変異株の解析を主に行った。CRISPR/Cas9を用いてMIRNA遺伝子座を標的として作出したmirna変異株の1つは、本来栄養成長を続ける葉状体が生殖器様に形態が変化していた。雌雄個体ともに生殖器様の形態を示したことから、このmiRNAは雌雄決定因子ではなく、栄養成長期から生殖成長期への相転換を通常時抑制していることが推測される。詳細に表現型を解析するため、変異体の走査型電子顕微鏡を用いた観察および切片観察を行なった結果、雄株の葉状体は精子を形成し、雌株の葉状体には造卵器が形成されていた。以上の結果から、このmiRNAはゼニゴケの栄養成長期から生殖成長期への相転換抑制因子であることが強く示唆された。miRNAは相補的な配列を持つmRNAに結合することで、標的遺伝子の発現を抑制するはたらきを持つ。そこで次に、表現型の原因となる標的遺伝子を同定することにした。前年度の研究により、プログラムによって塩基配列の相補性を元に行なったmiRNAの標的遺伝子予測、およびRACE方を用いた標的mRNAの切断部位同定の結果から、標的遺伝子としてすでに予測されていた遺伝子をRT-qPCR法によって定量し、変異株においてmRNAの蓄積量が増大していることがわかった。次にmiRNAと相補度合いの高い結合配列を、アミノ酸配列が変化しないよう同義置換した遺伝子配列をクローニングし、ベクターを用いて野生型植物体に遺伝子導入した形質転換体を作出した。miRNA耐性遺伝子の形質転換植物体は、雌雄ともにmirna変異株と同様に葉状体が生殖器官様に分化する表現型を示したことから、mirna変異体の表現型は、標的遺伝子の転写後発現抑制の欠損が原因であるということが強く示唆された。

2016年，我们主要分析了上一年产生的Sinensis microRNA（miRNA）的突变菌株。一个使用CRISPR/CAS9靶向miRNA基因座的miRNA突变体具有自然在营养上生长的丘疹，随着生殖器形态的变化。由于雌性和女性均表现出生殖器形态，因此据推测，这种miRNA不是男性和女性的决定因素，而是抑制从营养生长时期到正常生殖生长期的相过渡。为了详细分析表型，我们使用扫描电子显微镜和观察到的切片观察了突变体，并发现雄性菌株的丘疹形成了精子，而雌性菌株的丘疹形成了卵形。以上结果强烈表明，该miRNA是从营养生长阶段到列科生殖阶段的相变抑制剂。 miRNA通过与互补序列与mRNA结合来抑制靶基因的表达。因此，我们接下来决定确定引起表型的靶基因。上一年的一项研究表明，基于程序的基础序列的互补性和使用种族方法的裂解位点鉴定基于基础序列的互补性的靶基因预测，通过RT-QPCR方法量化了靶mRNA，并且突变株中mRNA积累的量增加。接下来，将具有同义替代具有高互补性的结合序列的基因序列克隆，以防止氨基酸序列变化，并通过使用载体将基因转移到野生型植物中产生转化剂。 miRNA抗性基因的转化植物表现出表型，其中丘疹在男女中分化了类似于miRNA突变体的生殖器官，并强烈建议miRNA突变体的表型是由靶基因表达的转录后抑制后的缺陷引起的。

项目成果

苔類ゼニゴケにおけるmicroRNAの機能解析

地钱中microRNA的功能分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 都筑正行，藤本剛史;西浜竜一;石崎公庸;栗原志夫;松井南;河内孝之;濱田隆宏;渡邊雄一郎
• 通讯作者: 渡邊雄一郎

Characterization of small RNAs in a liverwort, Marchantia polymorpha

地钱 (地钱) 中小 RNA 的表征

• 发表时间: 2015
• 作者: Masayuki Tsuzuki;Tsuyoshi Fujimoto;Ryuichi Nishihama;Kimitsune Ishizaki;Yukio Kurihara;Minami Matsui;Takayuki Kohchi;Takahiro Hamada;Yuichiro Watanabe
• 通讯作者: Yuichiro Watanabe

Profiling and characterization of microRNAs in the liverwort, Marchantia polymorpha

地钱、地钱中 microRNA 的分析和表征

• 发表时间: 2016
• 作者: 櫻井祐也;E. I. Vorobyov;細川隆史;吉田直紀;大向一行 & H. W. Yorke;Masayuki Tsuzuki
• 通讯作者: Masayuki Tsuzuki

Profiling New Small RNA Sequences

• DOI: 10.1007/978-1-4899-7708-3_14
• 发表时间: 2017-01-01
• 期刊: PLANT EPIGENETICS: METHODS AND PROTOCOLS, 2ND EDITION
• 作者: Tsuzuki, Masayuki;Watanabe, Yuichiro
• 通讯作者: Watanabe, Yuichiro

Monash University(オーストラリア)

莫纳什大学（澳大利亚）