耐性能力の異なるクマムシ種における乾眠誘導メカニズムの解析

今年度は、これまでに乾眠誘導への関与が示唆されていた候補遺伝子について、RNAiによるノックダウンにより、実際にヤマクマムシの乾眠に必要かどうかを検証した。前年度までにケミカルスクリーニングやトランスクリプトミクスによって見つけた遺伝子やその関連遺伝子の中から候補遺伝子を選別し、シグナル伝達分子や耐性に関わると考えられる10種類以上の様々な遺伝子を検証した。しかし、dsRNAが合成でき、ある程度のノックダウンが観察された遺伝子であっても、そのほとんどは乾眠への影響が見られなかった。原因の１つとして、ノックダウンが不十分であったことが考えられる。この問題を克服するためには、ゲノム編集によるノックアウト技術の確立や、より効率よくノックダウンできるようなRNAiの手法の確立が必要である。また、別の原因として、1遺伝子のノックダウンでは乾眠への影響が現れにくいことが考えられる。そのため、今後は複数の遺伝子を同時にノックダウンすることを試みる。検証した遺伝子のうち、ノックダウンによってヤマクマムシの乾眠が有意に阻害される遺伝子として、細胞膜局在タンパク質であるA8を同定した。A8は既知のタンパク質と相同性を持たないことから、クマムシ固有のタンパク質であると考えられるが、ドメイン検索により4回膜貫通のmarvelドメインを持つことが予測された。実際に、GFPを融合したA8をヒト培養細胞に導入し、局在を解析したところ、細胞膜への局在が確認された。また、RNAiによる乾眠阻害効果の解析から、このタンパク質は細胞膜の安定性に寄与する可能性が考えられた。これはクマムシ固有の膜たんぱく質が乾眠に必要であることを示した初めての報告例である。

今年度は、これまでに乾眠誘導への関与が示唆されていた候補遺伝子について、RNAiによるノックダウンにより、実際にヤマクマムシの乾眠に必要かどうかを検証した。前年度までにケミカルスクリーニングやトランスクリプトミクスによって見つけた遺伝子やその関連遺伝子の中から候補遺伝子を選別し、シグナル伝達分子や耐性に関わると考えられる10種類以上の様々な遺伝子を検証した。しかし、dsRNAが合成でき、ある程度のノックダウンが観察された遺伝子であっても、そのほとんどは乾眠への影響が見られなかった。原因の１つとして、ノックダウンが不十分であったことが考えられる。この問題を克服するためには、ゲノム編集によるノックアウト技術の確立や、より効率よくノックダウンできるようなRNAiの手法の確立が必要である。また、別の原因として、1遺伝子のノックダウンでは乾眠への影響が現れにくいことが考えられる。そのため、今後は複数の遺伝子を同時にノックダウンすることを試みる。検証した遺伝子のうち、ノックダウンによってヤマクマムシの乾眠が有意に阻害される遺伝子として、細胞膜局在タンパク質であるA8を同定した。A8は既知のタンパク質と相同性を持たないことから、クマムシ固有のタンパク質であると考えられるが、ドメイン検索により4回膜貫通のmarvelドメインを持つことが予測された。実際に、GFPを融合したA8をヒト培養細胞に導入し、局在を解析したところ、細胞膜への局在が確認された。また、RNAiによる乾眠阻害効果の解析から、このタンパク質は細胞膜の安定性に寄与する可能性が考えられた。これはクマムシ固有の膜たんぱく質が乾眠に必要であることを示した初めての報告例である。