骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持つ新規骨粗鬆症治療薬の臨床応用に向けた検証

兼具抑制骨吸收和促进骨形成作用的骨质疏松症新疗法的临床应用验证

• 批准号: 15J12476
• 负责人: 林 円香
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J12476/
• 关键词: IR/MAR法; scFv三量体; バイファンクショナル; 骨粗鬆症治療薬; IgG2; RANKL逆シグナル; 全長ヒトIgG2; 親和性成熟

前年度取得した、in vitroでバイファンクショナルな活性を示す全長抗体IgG2安定的に高発現する細胞株を取得するため、IR-MAR法を用い、目的のプラスミドをCHO-DG44細胞に導入し、薬剤選抜を行うことで、目的遺伝子を高発現する細胞クローンを単離濃縮した。この細胞を一定期間培養した後、培地を回収し、proteinAビーズ、およびRANKL細胞外ドメインの組換タンパク質をカップリングさせたCNBrビーズを用いて精製し、抗体の組換タンパク質を取得した。また、同様の活性を示すscFv三量体を用い、in vivoの検証を進めた。前年度のin vitroの検証により見出した、「RANKL逆シグナルは、骨芽細胞の分化前期を促進する一方、分化後期を抑制する」という知見に基づくと、生体での持続的なRANKL逆シグナル入力は、分化途上の未熟な骨芽細胞を蓄積させる一方、骨形成を担う分化後期の骨芽細胞の増加を抑制すると考えられる。そのため、RANKL逆シグナルを間欠的に入力することにより、シグナル入力期間中は初期の骨芽細胞が増加し、シグナルを解除すると、これらの骨芽細胞が成熟骨芽細胞、骨細胞にまで分化する可能性が推定された。そこで、野生型マウスにscFv三量体を5日間連続で腹腔内投与し、経時的に採血して骨代謝を反映する血清マーカーの変動を測定した。その結果、骨吸収マーカーであるTRAP5bが低下すると同時に、骨形成に関しては、初期骨芽細胞マーカーであるⅠ型コラーゲン-N-プロペプチド (P1NP)　が上昇した一方、後期骨芽細胞マーカーであるGla化Osteocalcinは低下した。また、投与を停止し、RANKL逆シグナルの影響が解除されると、蓄積した初期の骨芽細胞の後期分化段階への移行が進み、Gla化Osteocalcinは上昇を示した。以上の結果をまとめ、論文投稿準備中である。

Cell lines obtained in the past year, in vitro, in vitro The cells were cultured for a certain period of time, and the protein A and RANKL proteins were purified and purified. In vivo, scFv trisomers are used to demonstrate the same activity. In the past year, the evidence in vitro showed that "RANKL reverse osmosis promotes the early differentiation of bone bud cells and inhibits the late differentiation of bone bud cells." In addition, the evidence showed that RANKL reverse osmosis promotes the early differentiation of bone bud cells and inhibits the late differentiation of bone bud cells. The possibility of differentiation of bone bud cells into mature bone bud cells and bone cells was estimated during the initial period of stress. The three levels of scFv were determined by intraperitoneal injection and bone metabolism. As a result, TRAP5b decreased at the same time, bone formation was related, early bone bud cells increased at the same time, and late bone bud cells decreased at the same time. The effect of RANKL on the differentiation of osteoblasts was relieved, the accumulation of osteoblasts in the early stage of differentiation was advanced, and the Osteocalcin was increased. The above results are in preparation for submission.

项目成果

骨芽細胞におけるRANKL逆シグナルの役割

RANKL反向信号在成骨细胞中的作用

• 发表时间: 2015
• 作者: 本間雅;林円香;池淵祐樹;青木重樹;菅森泰隆;青木和広;鈴木洋史
• 通讯作者: 鈴木洋史

東京大学医学部附属病院薬剤部試験研究室／臨床薬物動態学教室

东京大学医院药学部药学研究室/临床药代动力学研究室