Analysis and Utilization for the Parthenogenetic silkworm

１）カイコの遺伝子組換えでは、産卵後８時間までの非休眠受精卵に外来遺伝子DNAを顕微鏡下で直接注射する。一方、単為発生処理では、メス蛾から採取した未受精卵を摂氏48度18分、摂氏15度15分の温度処理を行った後、摂氏15度3日間の保護を要する。顕微鏡観察により、単為発生による胚発生には、通常の受精卵の発生に比べて遅れが生じることが明らかになった。そこで実際に、温度処理後12時間から96時間の単為発生系統の未受精卵に外来遺伝子DNA（pPIGA3GFP）を注射し、核への取り込み状態を調べた。その結果、注射時期が早いほどDNAの核への取り込みが良好であるものの、48時間後の胚への注射であってもDNAは胚の核に取り込まれ、遺伝子を発現することが分かった。また、注射の時期を遅らせるにつれ孵化率が高くなった。２）単為発生系統カイコから採取される未受精卵はほぼ全てが休眠卵である一方、カイコの遺伝子組換えでは非休眠受精卵が必要である。そこで、単為発生系統と単為発生率の低い複数の系統との交配による次世代（F1）、次々世代（F2）を育成し、非休眠性が強く単為発生能の高いF2系統を選抜することに成功した。このF2系統の未受精卵に対して実際に遺伝子組換え操作を行った。温度処理後約１８時間を目安とし、外来遺伝子DNA（pBac3xP3GFP）を注射した当代のメス蛾から未受精卵を採取した後、温度処理により単為発生した次世代の発する緑色蛍光をスクリーニングすることで、単為発生する遺伝子組換えカイコを作出することに成功した。また、単為発生によって維持されるその後代がクローン化されていることを、ゲノムのサザン分析により確認した。さらに、遺伝子組換えカイコの卵巣の超低温耐性についても検討を加え、液体窒素による系統保存が可能であることを示した。

１）カイコの遺伝子組換えでは、産卵後８時間までの非休眠受精卵に外来遺伝子DNAを顕微鏡下で直接注射する。一方、単為発生処理では、メス蛾から採取した未受精卵を摂氏48度18分、摂氏15度15分の温度処理を行った後、摂氏15度3日間の保護を要する。顕微鏡観察により、単為発生による胚発生には、通常の受精卵の発生に比べて遅れが生じることが明らかになった。そこで実際に、温度処理後12時間から96時間の単為発生系統の未受精卵に外来遺伝子DNA（pPIGA3GFP）を注射し、核への取り込み状態を調べた。その結果、注射時期が早いほどDNAの核への取り込みが良好であるものの、48時間後の胚への注射であってもDNAは胚の核に取り込まれ、遺伝子を発現することが分かった。また、注射の時期を遅らせるにつれ孵化率が高くなった。２）単為発生系統カイコから採取される未受精卵はほぼ全てが休眠卵である一方、カイコの遺伝子組換えでは非休眠受精卵が必要である。そこで、単為発生系統と単為発生率の低い複数の系統との交配による次世代（F1）、次々世代（F2）を育成し、非休眠性が強く単為発生能の高いF2系統を選抜することに成功した。このF2系統の未受精卵に対して実際に遺伝子組換え操作を行った。温度処理後約１８時間を目安とし、外来遺伝子DNA（pBac3xP3GFP）を注射した当代のメス蛾から未受精卵を採取した後、温度処理により単為発生した次世代の発する緑色蛍光をスクリーニングすることで、単為発生する遺伝子組換えカイコを作出することに成功した。また、単為発生によって維持されるその後代がクローン化されていることを、ゲノムのサザン分析により確認した。さらに、遺伝子組換えカイコの卵巣の超低温耐性についても検討を加え、液体窒素による系統保存が可能であることを示した。