ｅｎＣｈＩＰ法を用いたミトコンドリアＤＮＡの転写調節機構の解明

哺乳動物細胞の遺伝情報は、核とミトコンドリアという二つの細胞内小器官に存在している。核内DNAについては、クロマチン構造や転写因子等が詳細に解析されている一方、ミトコンドリアDNA (mtDNA) の高次構造や転写調節機構については限られた情報しかない。本研究では、engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) 法を用いて、分子間相互作用を保ったままmtDNAの転写調節領域を単離し、そこに結合している分子（蛋白質・RNA等）を網羅的に同定して、それらの分子がmtDNAからの遺伝子発現等の機能発現に果たす役割を解析する。こうした解析によって、mtDNAのクロマチン構造や転写制御機構の詳細を解明する。当該年度には以下の研究を行った。mtDNAの転写を制御しているD-loop領域近傍に結合するTALタンパク質をコードする遺伝子に、ミトコンドリア局在シグナルと3xFLAGタグを融合させたタンパク質MF -MT-TALを発現するプラスミドを293T細胞に導入し発現させた。樹立した細胞にMF-MT-TALを発現させ、enChIP法によりmtDNAを効率良く単離することが可能であることが示されたため、enChIP操作後、単離したmtDNAに結合しているタンパク質を質量分析解析によって同定した。

哺乳動物細胞の遺伝情報は、核とミトコンドリアという二つの細胞内小器官に存在している。核内DNAについては、クロマチン構造や転写因子等が詳細に解析されている一方、ミトコンドリアDNA (mtDNA) の高次構造や転写調節機構については限られた情報しかない。本研究では、engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) 法を用いて、分子間相互作用を保ったままmtDNAの転写調節領域を単離し、そこに結合している分子（蛋白質・RNA等）を網羅的に同定して、それらの分子がmtDNAからの遺伝子発現等の機能発現に果たす役割を解析する。こうした解析によって、mtDNAのクロマチン構造や転写制御機構の詳細を解明する。当該年度には以下の研究を行った。mtDNAの転写を制御しているD-loop領域近傍に結合するTALタンパク質をコードする遺伝子に、ミトコンドリア局在シグナルと3xFLAGタグを融合させたタンパク質MF -MT-TALを発現するプラスミドを293T細胞に導入し発現させた。樹立した細胞にMF-MT-TALを発現させ、enChIP法によりmtDNAを効率良く単離することが可能であることが示されたため、enChIP操作後、単離したmtDNAに結合しているタンパク質を質量分析解析によって同定した。