ｅｎＣｈＩＰ法を用いたミトコンドリアＤＮＡの転写調節機構の解明

利用 enChIP 方法阐明线粒体 DNA 转录调控机制

• 批准号: 16J03639
• 负责人: 谷川 直紀
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Keio University (2017)Osaka University (2016)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J03639/
• 关键词: ミトコンドリア; 遺伝子座特異的クロマチン免疫沈降法; クロマチン; enChIP; TALタンパク質; ミトコンドリアDNA

哺乳動物細胞の遺伝情報は、核とミトコンドリアという二つの細胞内小器官に存在している。核内DNAについては、クロマチン構造や転写因子等が詳細に解析されている一方、ミトコンドリアDNA (mtDNA) の高次構造や転写調節機構については限られた情報しかない。本研究では、engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) 法を用いて、分子間相互作用を保ったままmtDNAの転写調節領域を単離し、そこに結合している分子（蛋白質・RNA等）を網羅的に同定して、それらの分子がmtDNAからの遺伝子発現等の機能発現に果たす役割を解析する。こうした解析によって、mtDNAのクロマチン構造や転写制御機構の詳細を解明する。当該年度には以下の研究を行った。mtDNAの転写を制御しているD-loop領域近傍に結合するTALタンパク質をコードする遺伝子に、ミトコンドリア局在シグナルと3xFLAGタグを融合させたタンパク質MF -MT-TALを発現するプラスミドを293T細胞に導入し発現させた。樹立した細胞にMF-MT-TALを発現させ、enChIP法によりmtDNAを効率良く単離することが可能であることが示されたため、enChIP操作後、単離したmtDNAに結合しているタンパク質を質量分析解析によって同定した。

Mammalian cells contain genetic information, nuclear information, and small intracellular organs. DNA in the nucleus, structure, writing factors, etc., are analyzed in detail, and high-order structure of DNA (mtDNA) and writing regulatory mechanisms are analyzed in detail. In this study, the engineered DNA-binding molecular-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) method was used to analyze the functional development of mtDNA binding molecules (protein, RNA, etc.), including the identification of mtDNA binding molecules, the identification of mtDNA gene expression, and the identification of mtDNA gene expression. The structure and control mechanism of mtDNA are analyzed in detail. When the year is over, the following studies are conducted. mtDNA gene expression is controlled in the D-loop region near the region, and the gene expression is induced in 293T cells by MT-TAL gene expression. To establish the MF-MT-TAL method, the mtDNA binding rate was determined by mass spectrometry.