ＤＮＡ損傷に伴うクロマチン構造変化の制御メカニズム解析

1. RAD54の相互作用因子の同定と機能解析シロイヌナズナDNA損傷応答においてRAD54は損傷ゲノム領域に集積してDNA修復フォーサイを形成するが、損傷領域を認識する分子メカニズムは不明であった。近年相同組換えにおいて相同組換え因子はヒストン修飾酵素やヒストンシャペロンと協調的に機能することが報告されていることから、RAD54の動態制御を担うエピジェネティック因子の同定を試みた。共免疫沈降及び質量分析の結果、RAD54の新規相互作用因子としてあるヒストン脱メチル化酵素(HDM)を同定した。BiFCアッセイ及び近接ライゲーションアッセイ(in situ PLA)によってもRAD54とHDMの相互作用は確認された。HDMはヒストンH3の4番目のジメチル(H3K4m2)の脱メチル化を介して遺伝子発現に寄与することから、RAD54とH3K4me2の関係解析を行った。In vitroプルダウンアッセイによりRAD54はH3K4me2に直接結合すること、HDM変異株においてRAD54とH3K4me2の相互作用頻度が増加していることがin situ PLAによりわかった。さらに、ChIP-qPCRによって、相同組換えにおいてH3K4me2はHDM依存的に減少することが明らかになった。これより、RAD54はH3K4me2を介して損傷領域に集積し、HDMはH3K4me2を脱メチル化してRAD54を適切なタイミングでクロマチンから解離させていることがわかった。2. DNA損傷応答に機能するクロマチン構造制御因子の逆遺伝学的スクリーニング前年度に単離したクロマチン構造制御因子の変異株におけるDNA損傷応答因子の発現解析を行った。その結果。DNA二本鎖切断処理時のDNA修復因子の発現量が低下していた。

1. RAD54の相互作用因子の同定と機能解析シロイヌナズナDNA損傷応答においてRAD54は損傷ゲノム領域に集積してDNA修復フォーサイを形成するが、損傷領域を認識する分子メカニズムは不明であった。近年相同組換えにおいて相同組換え因子はヒストン修飾酵素やヒストンシャペロンと協調的に機能することが報告されていることから、RAD54の動態制御を担うエピジェネティック因子の同定を試みた。共免疫沈降及び質量分析の結果、RAD54の新規相互作用因子としてあるヒストン脱メチル化酵素(HDM)を同定した。BiFCアッセイ及び近接ライゲーションアッセイ(in situ PLA)によってもRAD54とHDMの相互作用は確認された。HDMはヒストンH3の4番目のジメチル(H3K4m2)の脱メチル化を介して遺伝子発現に寄与することから、RAD54とH3K4me2の関係解析を行った。In vitroプルダウンアッセイによりRAD54はH3K4me2に直接結合すること、HDM変異株においてRAD54とH3K4me2の相互作用頻度が増加していることがin situ PLAによりわかった。さらに、ChIP-qPCRによって、相同組換えにおいてH3K4me2はHDM依存的に減少することが明らかになった。これより、RAD54はH3K4me2を介して損傷領域に集積し、HDMはH3K4me2を脱メチル化してRAD54を適切なタイミングでクロマチンから解離させていることがわかった。2. DNA損傷応答に機能するクロマチン構造制御因子の逆遺伝学的スクリーニング前年度に単離したクロマチン構造制御因子の変異株におけるDNA損傷応答因子の発現解析を行った。その結果。DNA二本鎖切断処理時のDNA修復因子の発現量が低下していた。