Development of highly efficient plant genome editing tools using CRISPR/Cas9

前年度では、リボザイムの配列を含まないSpCas9-gRNAベクターを用いて、イネとシロイヌナズナにおいて変異導入に成功した。しかし、今後のゲノム編集技術では、変異導入だけではなく、塩基置換や遺伝子のノックインが可能なGene Targetingの技術の開発も望まれた。そのため、本年度はCRISPR/Cas9を用いることで、植物におけるGene Targeting効率の向上を図るため、前年度に作成したSpCas9-gRNAベクターと、一般的なCRISPR/Cas9の発現系であるSpCas9/gRNAベクターを用いたGene Targeting系の構築を行った。この際、イネのアセト乳酸合成酵素遺伝子 （ALS）に対してGene Targetingでアミノ酸置換を導入することで効率の評価を行った。CRISPR/Cas9によるDNA二重鎖切断をALS遺伝子の2点変異近傍に起こすSpCas9/gRNAとSpCas9-gRNAの両方の系では、CRISPR/Cas9の発現がないコントロールの系に対して、Gene Targeting効率が向上したが、動物 （ヒト細胞やマウス等） の報告ほど著しい向上は見られなかった。また、SpCas9-gRNAの系では、SpCas9とgRNAを同時期に発現させることができるため、細胞周期の一部の時期のみしか起きない相同組換えを利用するGene Targetingにおいて、SpCas9/gRNAの系よりも優位であると期待していたが、両方の系においてALS遺伝子のGene Targeting効率の差はほとんどなかった。Gene Targeting効率のさらなる向上のため、イネカルスの選抜法の改良や、CRISPR/Cas9の発現ベクターの改良を加えたことで、ALS遺伝子でのGene Targeting効率は、約20倍程度向上させることができた。

前年度では、リボザイムの配列を含まないSpCas9-gRNAベクターを用いて、イネとシロイヌナズナにおいて変異導入に成功した。しかし、今後のゲノム編集技術では、変異導入だけではなく、塩基置換や遺伝子のノックインが可能なGene Targetingの技術の開発も望まれた。そのため、本年度はCRISPR/Cas9を用いることで、植物におけるGene Targeting効率の向上を図るため、前年度に作成したSpCas9-gRNAベクターと、一般的なCRISPR/Cas9の発現系であるSpCas9/gRNAベクターを用いたGene Targeting系の構築を行った。この際、イネのアセト乳酸合成酵素遺伝子 （ALS）に対してGene Targetingでアミノ酸置換を導入することで効率の評価を行った。CRISPR/Cas9によるDNA二重鎖切断をALS遺伝子の2点変異近傍に起こすSpCas9/gRNAとSpCas9-gRNAの両方の系では、CRISPR/Cas9の発現がないコントロールの系に対して、Gene Targeting効率が向上したが、動物 （ヒト細胞やマウス等） の報告ほど著しい向上は見られなかった。また、SpCas9-gRNAの系では、SpCas9とgRNAを同時期に発現させることができるため、細胞周期の一部の時期のみしか起きない相同組換えを利用するGene Targetingにおいて、SpCas9/gRNAの系よりも優位であると期待していたが、両方の系においてALS遺伝子のGene Targeting効率の差はほとんどなかった。Gene Targeting効率のさらなる向上のため、イネカルスの選抜法の改良や、CRISPR/Cas9の発現ベクターの改良を加えたことで、ALS遺伝子でのGene Targeting効率は、約20倍程度向上させることができた。