植物防御応答における細胞骨格系および膜輸送系の細胞表層動態のイメージング解析

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私はこれまで軟腐病細菌Erwinia carotovoraの培養液から菌体を除去した培養濾過液とタバコ培養細胞BY-2を用いた細胞死誘導系を確立し、濾過液誘導性細胞死において液胞に先立って細胞膜のintegrityが失われる新奇の細胞死様式を見出しました。しかし、新奇の細胞死過程における細胞骨格系の細胞表層動態に関する知見はありませんでした。そこで、細胞表層の観察に適した可変角蛍光顕微鏡を用いて濾過液誘導性細胞死におけるチューブリンマーカーGFP-tubulinの動態を観察しました。死細胞が高頻度に観察され始める濾過液処理後4時間目の細胞を観察したところ、表層微小管の構造は保持されていることが示唆されました。さらに、連続撮影によって濾過液処理後4時間目の細胞では表層微小管の重合や脱重合が観察されたことから、濾過液誘導性細胞死において表層微小管の構造や動態は保持されていることが示唆されました。次に、濾過液誘導性細胞死における表層アクチン繊維の変化を観察したところ、表層アクチン繊維は消失する可能性が示唆されました。濾過液誘導性細胞死過程では、細胞骨格系である表層微小管とアクチン繊維は異なる動態を示すことから、細胞死において異なる役割を担っている可能性が示唆されました。細胞死誘導初期の応答として、防御応答の誘導に関与する活性酸素種が産生することが知られています。ルミノール法により濾過液処理3分後までに一過的な活性酸素種（ROS）の産生が起こることを見出しました。さらに、濾過液処理後4時間目まで持続的なROS産生も検出されました。Ca2+キレート剤BAPTAまたはプロテインキナーゼ阻害剤k252aを処理したところ、一過的および持続的なROSを阻害しました。以上の結果より、濾過液処理によりCa2+の細胞内流入やリン酸化反応を介したROS産生機構が惹起される可能性が示唆されました。