胚性分泌因子ＷＮＴ１１がウシ着床前期胚発生に果たす役割の解明

今年度は、前年度までに確立した高力価のウイルスの作製技術をもとに、実際にウシ胚へのレンチウイルス媒介性遺伝子導入を行った。体外受精後の1細胞期において囲卵腔に高濃縮ウイルス液を注入した胚を胚盤胞期まで体外培養し、ゲノムDNA抽出を行い、外来遺伝子のPCRを行うことで、高効率の遺伝子導入を確認した。また、ウシ胚よりクローニングしたWNT11遺伝子のcDNAを発現する発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、RT-PCR、およびウエスタンブロッティングで高レベルの導入遺伝子の発現を確認している。また、胚盤胞期以降の胚発生を評価するためには前提として、胚盤胞期以降の急速な胚の退行を抑えるような培養系の開発が必要であると考えた。そこで、培地や培養基質を数種類検討することにより、従来の培養法と比べ大幅に胚の生存日数を延長することに成功した。この培養法により生存を延長した胚が、胚としての性質を維持していること、および分化が進行していることを評価するために、マーカー遺伝子の免疫染色、定量PCR等を行い、これを灌流により得られたvivo胚と比較することで、新規に開発した培養法により作出した胚における分化が、大部分vivoを反映していることが明らかとなった。胚盤胞期以降のウシ胚発生では、ICMから原始内胚葉、胚盤葉上層が分化し適切に配置されることが重要である。本研究では、原始内胚葉の適切なマーカー遺伝子も同定することができた。今後は、これらの材料を組み合わせることにより、WNT11が胚盤胞期胚以降のウシ胚発生における役割を評価することができる。

今年度は、前年度までに確立した高力価のウイルスの作製技術をもとに、実際にウシ胚へのレンチウイルス媒介性遺伝子導入を行った。体外受精後の1細胞期において囲卵腔に高濃縮ウイルス液を注入した胚を胚盤胞期まで体外培養し、ゲノムDNA抽出を行い、外来遺伝子のPCRを行うことで、高効率の遺伝子導入を確認した。また、ウシ胚よりクローニングしたWNT11遺伝子のcDNAを発現する発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、RT-PCR、およびウエスタンブロッティングで高レベルの導入遺伝子の発現を確認している。また、胚盤胞期以降の胚発生を評価するためには前提として、胚盤胞期以降の急速な胚の退行を抑えるような培養系の開発が必要であると考えた。そこで、培地や培養基質を数種類検討することにより、従来の培養法と比べ大幅に胚の生存日数を延長することに成功した。この培養法により生存を延長した胚が、胚としての性質を維持していること、および分化が進行していることを評価するために、マーカー遺伝子の免疫染色、定量PCR等を行い、これを灌流により得られたvivo胚と比較することで、新規に開発した培養法により作出した胚における分化が、大部分vivoを反映していることが明らかとなった。胚盤胞期以降のウシ胚発生では、ICMから原始内胚葉、胚盤葉上層が分化し適切に配置されることが重要である。本研究では、原始内胚葉の適切なマーカー遺伝子も同定することができた。今後は、これらの材料を組み合わせることにより、WNT11が胚盤胞期胚以降のウシ胚発生における役割を評価することができる。