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カルシウム透過性電位センサーを用いた新規光遺伝学ツールの作製

使用钙渗透电位传感器创建新型光遗传学工具

基本信息

批准号：
17J02119
负责人：
有馬大貴
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J02119/
关键词：
カルシウムイオン透過電位センサードメイン

项目摘要

まず、Ca2+透過性電位センサードメインがどのようにCa2+透過路を形成しているかを変異体を用いた実験により調べた。その結果、4つの膜貫通領域のうち2番目の膜貫通領域のN末端側にあるリジンおよび3番目と4番目の膜貫通領域の間にあるグルタミン酸がイオン透過路の入り口を形成していることが分かった。続いて、膜貫通領域内でイオン透過路の形成に関わるアミノ酸の探索を行った。Ca2+などの正に帯電したイオンが疎水性環境である膜を通過するためには、膜貫通領域において酸性アミノ酸と相互作用しながら進む必要がある。そこで、膜貫通領域およびその近傍に存在する酸性アミノ酸ひとつひとつに変異を導入し、Ca2+透過が阻害されるかどうかを調べた。しかしながら、すべての変異体において野生型と同等のCa2+透過が見られたため、イオン透過路の形成に必須なアミノ酸を同定することはできなかった。また、光駆動性カルシウムチャネルの候補分子を探索するためのスクリーニング系の構築を行った。この系の確立には、Ca2+チャネルを欠損した変異型出芽酵母株 (H317) を用いた。H317はa-factorと呼ばれるホルモンで刺激されると細胞死を起こすが、Ca2+透過性のイオンチャネルを強制発現させることでその細胞死を防ぐことができる。実際、H317に欠損しているCCH1を強制発現させてa-factor刺激を行い、細胞生存率をメチレンブルー染色により調べた結果、生存率は90.0±0.93%であった。一方、CCH1を発現させなかった場合の生存率は56.1±1.03%であり、CCH1を戻した場合と比べて有意に生存率が低かった (mean±SEM, n = 3, p < 0.01 by Tukey’s test)。これにより、酵母を用いてCa2+透過性を持つイオンチャネルのスクリーニングする系が確立した。

The Ca2 + transmission potential is adjusted by changing the Ca2 + transmission path. As a result, the membrane penetration area of 4 parts is formed on the N terminal side of the membrane penetration area of 2 parts and the membrane penetration area of 3 parts and 4 parts is formed on the inlet of the transmission path. In the field of film penetration, we are exploring the formation of infrared channels related to the formation of infrared acids. Ca2 + ions are charged in aqueous environment, membrane passes through, membrane penetrates through, acid interacts with, and is necessary for the development of Ca2 + ions. In addition, the membrane penetration field is close to the existence of acid, acid and calcium. The formation of the Ca2 + pathway requires the formation of an acid pathway. To explore the candidate molecules of the photodynamic cluster and to construct the cluster system This system was established and Ca2 +-induced failure was observed in heterotrophic yeast strain H317. H317 a-factor, Ca2 + permeability, cell death, stress, cell death, cell death. In the meantime, H317 was damaged by CCH1 stress, and the survival rate of cells was 90.0±0.93%. The survival rate in the case of one party and CCH1 was 56.1±1.03%, which was lower than that in the case of intentional use (mean±SEM, n = 3, p < 0.01 by Tukey's test). The Ca2 + permeability of yeast and yeast is well established.