新規神経栄養因子 MANF ファミリーによる細胞保護機構の解明

新型神经营养因子MANF家族阐明细胞保护机制

基本信息

批准号：
17J02322
负责人：
則定純平
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J02322/
关键词：
MANF ER stress ERAD

项目摘要

小胞体ストレスは、パーキンソン病などの神経変性疾患、糖尿病、がん等の発症及び進行の原因の一つと考えられている。本研究では、神経栄養因子且つ小胞体ストレス応答性因子mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic facter (MANF)を標的とし、MANF欠損による小胞体ストレス応答への影響を解析することを目的とした。■MANF 欠損細胞株の樹立およびその性状解析本研究では、以前当研究室で構築した簡便な薬剤選択によるCRISPR/Cas9システムを用いてマウス神経細胞株N2aにおけるMANF欠損細胞株を樹立した。小胞体ストレス誘導剤ツニカマイシン(Tm)処理をおこなったところ、樹立した欠損細胞ではMANFの発現量が完全に消失していたものの、小胞体ストレスマーカーの発現量は野生型細胞と同様であった。一方で、小胞体関連分解(ERAD)に関わる因子の発現量変化を解析したところ、Tm誘導性小胞体ストレスにより、レクチン様タンパク質OS9の発現量が野生型N2a細胞に比べ有意に増加していた。■ERADモデルタンパク質NHKの二量体化に対する簡便な解析法の構築α-1 antitrypsin変異体NHKをERAD基質モデルタンパク質として用いて、MANF 欠損がERAD 機構に及ぼす影響を解析した。NHKの多量体化に着目した解析をおこなったところ、MANF欠損型N2a細胞では、Tm誘導性小胞体ストレス時でのOS9発現誘導が増加したにもかかわらず、Tm処理時での多量体NHKは野生型N2a細胞と同程度であった。いくつかの小胞体局在タンパク質はERAD基質となることが報告されているため、MANFがOS9の安定性に寄与している可能性がある。今後、MANFがOS9又は、他の小胞体局在タンパク質に及ぼす影響を検討することがMANFの生理機能解明に必要である。

内质网应激被认为是神经退行性疾病（例如帕金森氏病，糖尿病，癌症等）发作和进展的原因之一。这项研究针对神经营养因子和内质网应激反应因子（MANF），旨在分析MANF缺乏症对内质网应激反应的影响。 ■在这项研究中，我们使用先前先前在实验室中构建的简单药物选择CRISPR/CAS9系统建立了MANF缺陷型细胞系及其特性，在小鼠神经元细胞系N2A中建立了MANF缺陷细胞系。当内质网应激诱导剂穿刺霉素（TM）时，MANF的表达水平在既定的有缺陷的细胞中完全丢失，但是内质网应激标志物的表达水平与野生型细胞的表达水平相同。另一方面，当我们分析与内质网相关降解（ERAD）相关的因子的表达水平变化时，与野生型N2A细胞相比，TM诱导的内质网应激表明，凝集素样蛋白OS9的表达水平显着增加。 ■构建一种简单的分析方法，用于二聚化的ERAD模型蛋白NHKα-1抗胰蛋白酶突变体NHK用作ERAD底物模型蛋白，以分析MANF缺乏症对ERAD机制的影响。当我们进行了针对NHK多聚化的分析时，在缺乏MANF的N2A细胞中，尽管在TM诱导的内质网应激期间诱导OS9表达的诱导增加，TM处理期间的多聚体NHK与野生型N2A细胞相似。由于据报道几种内质网局部蛋白质是ERAD底物，因此MANF可能有助于OS9稳定性。将来有必要研究MANF对OS9或其他局部内质网蛋白的影响，以阐明MANF的生理功能。