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ＲＮＡアプタマースイッチを利用した低オフターゲット効果ゲノム編集法の開発

开发使用RNA适体开关的低脱靶效应基因组编辑方法

基本信息

批准号：
17J08531
负责人：
松本大亮
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J08531/
关键词：
ゲノム編集 CRISPR 抗CRISPR 相同性組換え細胞周期 CRISPR/Cas9 RNAアプタマー

项目摘要

現在ゲノム編集技術において主に用いられる配列特異的なDNA切断酵素であるCRISPR/Cas9システム（CRISPR）に対して、近年報告されたCRISPR阻害タンパク質である抗CRISPR分子を組み合わせることで、細胞周期依存的に活性化できるCRISPR制御系を構築した。本研究の目的は相同性組換えが高頻度で起こるS/G2期においてDNA二本鎖切断を導入することにより、正確性の高いゲノム編集を行うことである。当初の研究実施計画では、CRISPRの配列認識に用いられるガイドRNAをRNAアプタマーを利用して阻害し、このRNAアプタマーが細胞周期に応じてスイッチする系を試みた。しかし、アプタマーの入手が困難であったため、抗CRISPR分子を用いることとした。哺乳類細胞において細胞周期のS期からM期の間での分解を促進するCdt1由来のアミノ酸配列を抗CRISPR分子（AcrIIA4）に融合したAcrIIA4-Cdt1を構築した。これにより、G1期ではAcrIIA4によるCas9活性の阻害、S期以降ではAcrIIA4の分解によるCas9の活性化が可能となる。実際に、ゲノム編集の正確性の向上を確認することができた。本手法では、ベクターを工夫することによってDNAを導入するのみで自律的にCRISPRの細胞周期依存的な活性化が可能である。そのため、薬剤を用いた細胞の同調培養やCas9タンパク質やガイドRNAの精製も不要であり、細胞にとって低侵襲でかつ低コストな手法である。また、相同性組換えを介した標的配列での正確な修復効率の向上に加え、標的外での配列における変異導入（オフターゲット作用）の低減も確認できた。したがって、本手法はゲノム編集技術の医学分野やバイオ産業分野への応用が期待される。

Nowadays, CRISPR/Cas9 CRISPR (CRISPR), a specific DNA-cleaving enzyme engineered with CRISPR, has been reported in recent years. The CRISPR-blocking system is composed of anti-CRISPR molecules and the activation of the cell cycle-dependent CRISPR control system is constructed. The purpose of this study is to use homogeneous group replacement and high-frequency S/G2 phase DNA. This lock is cut and imported, and the accuracy is high and the editing is done. The initial research and implementation plan and the application of CRISPR's alignment and recognition were implemented using RNA and RNA.マーを utilizes して hindrance し, このRNA アプタマーがcell cycle に応じてスイッチするsystem をtrial みた.しかし, アプタマーの不了がであったため, anti-CRISPR molecules are used いることとした. Mammalian cell cycle, S phase, M phase, decomposition promotion, Cdt1 origin, acid compound The anti-CRISPR molecule (AcrIIA4) was constructed by fusion with AcrIIA4-Cdt1. The activity of AcrIIA4 and Cas9 is blocked in the G1 phase, and the decomposition of AcrIIA4 and the activation of Cas9 are possible in the S phase. The correctness of the compilation of 実记に and ゲノム has been confirmed. This method allows the introduction of self-regulatory CRISPR cell cycle-dependent activation of DNA into the DNA.そのため、薬剤を Use いたcells to synchronize culture and やCas9 タンパク性やガイドRN A's refined もであり, cell にとってlow invasion でかつlow コストな technique である.また、Identical group replacement えを Introduction したThe arrangement of the standard is correct なThe repair efficiency is improved に Increase え、The standard The external arrangement of the における変different import (オフターゲットeffect) is a reduction and confirmation of the できた.したがって、This technique はゲノムCompilation technology のmedical division やバイオIndustrial division への応用が灕れる.