Development of sequential and reaction process with monolithic column module for small antibodies PEGylation

点击翻译按钮获取中文摘要

今年度は、連続式断片化抗体生成操作の収率と反応操作条件の検討を行った。スケールアップが容易な片化酵素固定化担体として多孔性微粒子担体を使用し、長さ・内径の異なるカラムに充填し、流通式の反応カラムとして利用した。カラム内の物質移動特性を解析するために、低分子量サンプルとしてビタミンVB12(分子量1355 g/mol)を使用し、9～95塩基のpolyT(分子量2676～28837 g/mol)を用いて、カラム溶出時のピーク幅を測定し、細孔内における有効拡散係数を求めた。50塩基から95塩基のpolyTの分子半径が6～8 nmであり、がIgG抗体と同定の分子サイズとなる。VB12の溶出ピークの流速依存性は、ほとんどなく、担体における拡散抵抗はほぼ無いことが分かった。一方、50塩基、95塩基のpolyTは、速い流速では、ピークの分裂が起こり、細孔に入らずにカラムを通過するフラクションが観測された。今回、用いた固定化担体の粒子サイズは約200～400μmと大きな担体であったため、今後は、粒子サイズの小さい固定化担体を使用する予定である。反応カラムをカラムオーブン内に設置し、10℃から40℃で温度の検討も行ったところ、温度とともに拡散係数が増加する結果が得られたが、素通りする画分は以前として残った。また、昨年度までに構築した、後続にprotein Aおよびprotein Lのアフニティークロマトカラムを接続し、連続的に断片化抗体の生成と分離回収を行った。反応収率が60%まで高くなると、過剰に分解された抗体断片の素通りが見られたが、30%程度の収率であれば、未反応IgGと断片化抗体の回収が可能であることが電気泳動により確認できた。今後は、分離カラムにおける精製効率および断片化生成物に対する温度の影響も考慮して、より高温での反応操作条件について検討する予定である。