Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ卵作出系を応用した新規手法によるインプリント機構の解明

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本年度は、これまでに確立した卵特異的遺伝子ノックダウンシステムの作用機序についてより詳細な解析を進めたとともに、卵形成におけるヒストン脱メチル化酵素の包括的な阻害による影響を調べた。1) 人工microRNAによる卵特異的遺伝子ノックダウン：前年度までに、卵母細胞で発現するZp3遺伝子のイントロンに人工的に配列を設計したmicroRNA様配列(amiRNA)を挿入することで、成長期以降の卵母細胞に特異的な遺伝子ノックダウン効果が得られることがわかった。本年度は、ノックダウンマウスの様々なステージの卵母細胞における外来amiRNA発現プロファイルを明らかにした。また、内在性遺伝子を標的とした場合のノックダウン効果の検証を行ったことで、本システムによるノックダウン効果はamiRNA転写のホスト遺伝子Zp3と標的となる内在性遺伝子の新規転写が起こるタイミングの同期性が重要であると考えられた。本研究成果を学術論文として発表した。2) 卵成長過程におけるヒストンH3K4脱メチル化遺伝子の多重阻害：ゲノムインプリンティングの確立に重要なヒストンH3における4番目のリジン(H3K4)の脱メチル化現象に着目し、卵母細胞で発現するH3K4脱メチル化酵素遺伝子群Kdmファミリーをin vitroで多重に阻害した。1)で利用したamiRNAをポリシストロニックに連結することで最大10個のamiRNAを単一の転写ユニットから発現できる系を構築し、このコンストラクトをインプリント確立前の卵母細胞に顕微操作により導入して成長完了卵を得た。その結果、機能既知のKdm1aやKdm1bだけでなく、機能未知のKdm遺伝子群も卵におけるH3K4脱メチル化に関与することがわかった。今後これら機能未知のKdm遺伝子群がインプリント領域を直接的に制御するのかを検証する必要がある。