Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ卵作出系を応用した新規手法によるインプリント機構の解明

使用体外产蛋系统的新方法阐明印记机制

• 批准号: 18J01481
• 负责人: 佐々木 恵亮
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J01481/
• 关键词: 卵母細胞; ゲノム編集; microRNA; RNAi; エピジェネティクス; ヒストン修飾; ゲノムインプリンティング; レンチウイルス; 卵; 卵巣培養

本年度は、これまでに確立した卵特異的遺伝子ノックダウンシステムの作用機序についてより詳細な解析を進めたとともに、卵形成におけるヒストン脱メチル化酵素の包括的な阻害による影響を調べた。1) 人工microRNAによる卵特異的遺伝子ノックダウン：前年度までに、卵母細胞で発現するZp3遺伝子のイントロンに人工的に配列を設計したmicroRNA様配列(amiRNA)を挿入することで、成長期以降の卵母細胞に特異的な遺伝子ノックダウン効果が得られることがわかった。本年度は、ノックダウンマウスの様々なステージの卵母細胞における外来amiRNA発現プロファイルを明らかにした。また、内在性遺伝子を標的とした場合のノックダウン効果の検証を行ったことで、本システムによるノックダウン効果はamiRNA転写のホスト遺伝子Zp3と標的となる内在性遺伝子の新規転写が起こるタイミングの同期性が重要であると考えられた。本研究成果を学術論文として発表した。2) 卵成長過程におけるヒストンH3K4脱メチル化遺伝子の多重阻害：ゲノムインプリンティングの確立に重要なヒストンH3における4番目のリジン(H3K4)の脱メチル化現象に着目し、卵母細胞で発現するH3K4脱メチル化酵素遺伝子群Kdmファミリーをin vitroで多重に阻害した。1)で利用したamiRNAをポリシストロニックに連結することで最大10個のamiRNAを単一の転写ユニットから発現できる系を構築し、このコンストラクトをインプリント確立前の卵母細胞に顕微操作により導入して成長完了卵を得た。その結果、機能既知のKdm1aやKdm1bだけでなく、機能未知のKdm遺伝子群も卵におけるH3K4脱メチル化に関与することがわかった。今後これら機能未知のKdm遺伝子群がインプリント領域を直接的に制御するのかを検証する必要がある。

This year は, こ れ ま で に establish し た egg specific heritage 伝 son ノ ッ ク ダ ウ ン シ ス テ ム の function machine sequence に つ い て よ り detailed analytical を into め な た と と も に, egg formation に お け る ヒ ス ト ン メ off チ ル phenoloxidase の including な resistance against に よ る influence を adjustable べ た. 1) Artificial microRNAによる ovul-specific progeny 伝 ノッ ダウ ダウ 伝 : Before the annual ま で に, oocyte で 発 now す る Zp3 heritage 伝 son の イ ン ト ロ ン に artificial に match column を design し た mirnas others with column (amiRNA) を scions into す る こ と で, growth in の oocytes に な of specific 伝 son ノ ッ ク ダ ウ ン fruit comes unseen が ら れ る こ と が わ か っ た. This year は, ノ ッ ク ダ ウ ン マ ウ ス の others 々 な ス テ ー ジ の oocytes に お け る foreign amiRNA 発 now プ ロ フ ァ イ ル を Ming ら か に し た. ま た, internality but 伝 を mark と し た occasions の ノ ッ ク ダ ウ ン unseen fruit の 検 line card を っ た こ と で, this シ ス テ ム に よ る ノ ッ ク ダ ウ ン unseen fruit は amiRNA planning write の ホ ス ト posthumous son 伝 Zp3 と mark と な る internality heritage 伝 son の new planning rules written が こ る タ イ ミ ン グ の synchronism が important で あ る と exam え ら れ た. The research results of this study を academic paper と て て presentation た 2) Multiple hindrances during the growth process of the egg: におけるヒスト <e:1> H3K4 degassing メチ メチ transformation and leaving 伝 offspring. ゲ ノ ム イ ン プ リ ン テ ィ ン グ に の established important な ヒ ス ト ン H3 に お け る four times eye の リ ジ ン (H3K4) の メ off チ ル phenomenon に mesh し, oocyte で 発 now す る H3K4 メ off チ ル phenoloxidase heritage 伝 subgroup Kdm フ ァ ミ リ ー を in vitro で multiple に resistance against し た. 1) で using し た amiRNA を ポ リ シ ス ト ロ ニ ッ ク に link す る こ と で 10 largest の amiRNA を 単 a の planning write ユ ニ ッ ト か ら 発 now で き る を build し, こ の コ ン ス ト ラ ク ト を イ ン プ リ ン ト established before の oocytes に 顕 micro operations に よ り import し た を て grow up eggs. そ の result, function already know の Kdm1a や Kdm1b だ け で な く, function unknown の Kdm heritage 伝 subgroup も eggs に お け る H3K4 メ off チ ル change に masato and す る こ と が わ か っ た. Future こ れ ら function unknown の Kdm heritage 伝 subgroup が イ ン プ リ ン を direct に ト field suppression す る の か を 検 card す る necessary が あ る.

项目成果

卵母細胞特異的遺伝子ノックダウンシステムの開発

卵母细胞特异性基因敲低系统的开发

• 发表时间: 2019
• 作者: 佐々木恵亮;尾畑やよい
• 通讯作者: 尾畑やよい

Ectopic expression of DNA methyltransferases DNMT3A2 and DNMT3L leads to aberrant hypermethylation and postnatal lethality in mice

• DOI: 10.1002/mrd.23137
• 发表时间: 2019-06-01
• 期刊: MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT
• 影响因子: 2.5
• 作者: Sasaki，Keisuke;Hara，Satoshi;Obata，Yayoi
• 通讯作者: Obata，Yayoi

卵母細胞特異的ノックダウンシステムの確立

卵母细胞特异性敲低系统的建立

• 发表时间: 2019
• 作者: 佐々木恵亮;高岡沙綾;尾畑やよい
• 通讯作者: 尾畑やよい