卵子型エピゲノム形成におけるH3K36メチル化酵素ファミリーの機能解明

H3K36 甲基转移酶家族在卵母细胞型表观基因组形成中的功能阐明

• 批准号: 21K15000
• 负责人: 佐々木 恵亮
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15000/
• 关键词: 卵; エピジェネティクス; ヒストン修飾; ゲノム編集; 卵子; microRNA; RNA干渉

H3K36メチル化酵素遺伝子の冗長性を検証するための卵特異的多重ノックダウンマウスは現在作成中である。これまではゲノム編集によって卵特異的に発現する遺伝子のイントロンに人工的に配列をデザインしたマイクロRNA様配列（amiRNA）をノックインする戦略をとっていたが、遺伝子ノックダウン効率に問題が生じる可能性が考えられた。現在はamiRNAのコピー数を増加させてより強力なサイレンシング効果を得るという意図のもと、卵特異的にamiRNAを発現可能なベクター系を構築し、これを用いたトランスジェニックマウスを作成している。H3K36メチル化酵素遺伝子を欠失させた単一遺伝子のノックアウトマウス作出にも着手した。まずは遺伝子欠損による致死性の報告がないNsd3のノックアウトマウスを作成し、複数ラインのノックアウトマウスが樹立できた。現在は交配によりホモノックアウトを作成中である。Nsd1、Nsd2およびSetd2については卵特異的に遺伝子阻害をする必要があるため、コンディショナルノックアウトかamiRNAによる卵特異的ノックダウンのいずれかを検討している。また、本研究ではCUT&RUNによるヒストン修飾の全ゲノムプロファイルを実施する予定であったが、CUT&RUNよりもローインプットなCUT&Tag法に切り替えた。ライブラリ調製にあたっては、常法を改変して細胞吸着磁気ビーズフリーかつ成長完了卵に適したプロトコルを確立できた。野生型マウス卵を用いてヒストンH3における36番目のリジン残基のトリメチル化（H3K36me3）およびH3K27me3修飾について、現在シークエンス解析中である。

目前正在创建卵特异性多重敲低小鼠，以验证H3K36甲基酶基因的冗余。到目前为止，该策略是用基因组编辑在鸡蛋中特异性地表达的基因内含子上的microRNA样序列（AMIRNA），但基因敲低效率可能会出现问题。目前，为了增加amirna的拷贝数以获得更强的沉默效果，我们已经构建了一个可以表达杏仁蛋的矢量系统，并使用此构建了转基因小鼠。我们还开始用从H3K36甲基酶基因中删除的单个基因产生基因敲除小鼠。首先，我们创建了由于基因缺乏而没有报道致死性的NSD3敲除小鼠，并建立了多种敲除小鼠。目前，正在通过交配创建同句。由于NSD1，NSD2和SETD2需要卵特异性基因抑制，因此我们正在考虑有条件的敲除或Amirna的卵特异性敲低。在这项研究中，我们计划通过剪切和运行进行组蛋白修饰的整个基因组概况，但我们切换到低输入切割和标签方法而不是剪切和运行。在图书馆的准备中，修改了常规方法以建立适合细胞吸附的无磁性鸡蛋和成年卵的方案。目前，使用野生型小鼠卵在组蛋白H3中，三甲基化（H3K36ME3）和H3K27ME3在组蛋白H3中的赖氨酸残基的修饰目前正在测序中。

项目成果

転写因子Cdx2の下方制御はマウス壁栄養外胚葉の分化及び胚盤胞のoutgrowthに必要である

小鼠壁层滋养外胚层分化和囊胚生长需要转录因子 Cdx2 的下调

• 发表时间: 2022
• 作者: 鈴木 大介;佐々木 恵亮;小川 英彦
• 通讯作者: 小川 英彦