非対称オノセロイド生合成経路の特異性の進化デザイン

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本研究では、申請者が博士課程の研究対象として慣れ親しんできた変異型BmeTC（B. megaterium由来テルペン環化酵素）をモチーフとし、カロテノイド生合成にみられる機構とは異なる非対称性の創出戦略におけるニューロジックを検証する。究極の目標は、1つの酵素BmeTC変異体に、2つの環化機能をあえて保持させたまま、しかし片端を参照し「それとは異なるタイプの」末端構造を、残った端に導入するための仕組みを創出することにある。申請書計画通り1年目は進化型BmeTCのスクリーニングのため、「進化型BmeTC（酵素の安定性を高めるよう進化させたBmeTC）ライブラリーの作製」を行った。当研究室ではすでにSHC（スクアレンホペン環化酵素）においてスクアレン消費を指標にしたスクリーニング系を用い、新規天然物の発見や、反応性に富んだSHCの開発に成功している（未発表）。SHCと同様の系にランダム変異を加える前のBmeTCを入れ、スクリーニングが可能であるか確認した。ライブラリー作成に着手したところ、大腸菌に対して致死性を示すようになり、様々な条件検討を行った。大腸菌に対する致死性に関して問題点は無くなり、現在ライブラリーを作成しているところである。既にSHCと同様の系でスクリーニングが可能であったため、今後、この系を用いて酵素の安定性に優れた株の菌体抽出物と、スクアレン基質として酵素反応を行っていく。酵素反応生成物をHPLC-MS解析することで非対称生合成酵素のスクリーニングを行う。さらに基質が酵素に結合したX線結晶構造解析を行い、どのように基質を認識しているのかを明らかにし、「非対称生合成機構」を解明する予定である。