比較トランスクリプトーム解析に基づくシロイヌナズナ受精卵の極性化機構の解明

基于比较转录组分析阐明拟南芥受精卵极化机制

基本信息

批准号：
18J10512
负责人：
木全祐資
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J10512/
关键词：
植物発生学細胞極性トランスクリプトーム

项目摘要

受精卵の極性化を制御する実働因子の同定を目指し、受精卵のトランスクリプトーム解析を行った。本年度はまず、受精卵を胚珠から単離・回収するための手法の開発に取り組んだ。はじめに、発生後期の胚の単離法などを参考に、実体顕微鏡下で胚珠を解剖して受精卵を単離することを試みた。しかしながら、この方法では胚珠の切断場所などを検討しても、受精卵を遊離させることができなかった。そこで、当研究室の先行研究で実施された卵細胞の単離の方法を参考にして、胚珠を細胞壁分解酵素で処理することで、受精卵をプロトプラスト化して遊離させることを目指した。しかしながら、酵素処理のみでは受精卵は遊離しなかったため、さらに胚珠を物理的に破砕する操作を加えた。様々な条件検討の末、受精卵を遊離させることに成功した。次に、上記の方法で野生型の受精卵を30個回収して、市販のキットを用いてmRNAを抽出してからcDNAを合成・増幅し、中部大学の鈴木孝征博士との共同研究として、次世代シーケンサーによるRNA-seqを行った。しかし、1サンプルあたり1000万リードを見込んでシークエンシングしたにもかかわらず、30個の受精卵からはおよそ10万リードしか検出できず、遺伝子発現を解析するには不十分であった。そこで、回収する受精卵の個数を増やし、さらにライブラリー濃縮のためのPCRのサイクル数も変更したことで、十分な量のリード数を検出できるようになった。以上の検討によって、受精卵の遺伝子発現を精確に解析するためのサンプル調整方法が確立できたと考えられた。そこで、この方法で得られたトランスクリプトームデータの信頼性を確かめるために、卵細胞のトランスクリプトームデータと比較した。その結果、受精卵では卵細胞と比べて、6000以上の遺伝子が特異的に発現していることがわかった。

我们对受精卵进行了转录组分析，以鉴定控制受精卵极化的活性因子。今年，我们首先致力于开发一种从胚珠中隔离和收集受精卵的方法。首先，我们试图使用在发育后期的胚胎分离等方法来通过在立体显微镜下剖析卵子来隔离受精卵。但是，这种方法即使在检查了胚珠切割的位置后也不允许释放受精卵。因此，我们使用了分离实验室先前研究中进行的卵细胞的方法来发展原生质体并通过用细胞壁降解酶处理胚珠来释放受精卵。但是，由于仅酶治疗未释放受精卵，因此进一步采用了物理粉碎胚珠的手术。检查了各种条件后，我们能够释放受精卵。接下来，使用上述方法收集了30个野生型受精卵，使用市售试剂盒提取mRNA，并合成和放大cDNA，并与Chubu University的Suzuki Takayuki博士合作，使用下一代测序仪进行RNA-Seq。然而，尽管每样品的预期读数为1000万次，但在30个受精卵中只能检测到大约100,000次读取，这不足以分析基因表达。因此，通过增加要收集的受精卵的数量，并改变了PCR富含PCR的循环数量，可以检测到足够数量的铅。上述研究表明，已经建立了一种样品调整方法，以准确分析受精卵中的基因表达。因此，为了验证该方法获得的转录组数据的可靠性，我们将其与卵细胞的转录组数据进行了比较。结果，发现与卵细胞相比，在受精卵中特别表达了6,000多个基因。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Intracellular dynamics controlling Arabidopsis zygote polarization

控制拟南芥合子极化的细胞内动力学

DOI：
发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kimata Yusuke;Kato Takehide;Higaki Takumi;Kurihara Daisuke;Yamada Tomomi;Segami Shoji;Morita Terao Miyo;Maeshima Masayoshi;Hasezawa Seiichiro;Higashiyama Tetsuya;Tasaka Masao;Ueda Minako
通讯作者：
Ueda Minako

ライブイメージングによる受精卵の極性化における液胞の動態と役割の解明

使用实时成像阐明液泡在受精卵极化中的动力学和作用