Development of the translation machinery to incorporate multiple D-amino acids into a peptide via alteration of the ribosome tunnel

开发翻译机制，通过改变核糖体通道将多个 D-氨基酸整合到肽中

• 批准号: 18J12342
• 负责人: 田島 研也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12342/
• 关键词: ペプチジル-tRNAの脱落; リボソームストール; EF-P; プロリン; ペプチド新生鎖; 翻訳系; D-アミノ酸; リボソーム; ペプチジル-tRNA; L-プロリン

本研究は、ペプチド鎖へのD-アミノ酸導翻訳効率を指標としてペプチド新生鎖配列を分類し、任意のペプチド新生鎖に効率よくD-アミノ酸を導入可能な変異体リボソームの開発を目的としている。D-アミノ酸を含むペプチドはその高いプロテアーゼ耐性によって生体内で長期間作用するペプチド薬剤開発の基盤として期待される。近年の試験管内翻訳系の最適化とD-アミノ酸導入に用いるtRNAの改良によりペプチドへのD-アミノ酸連続導入が可能となったが、L-アミノ酸と比較して導入効率は未だ非常に低い。本研究では、D-アミノ酸導入効率が導入されるペプチド新生鎖配列に依存するという知見に基づき、ペプチド新生鎖が通過するリボソームのトンネルを最適化することで導入効率の向上を目指した。昨年度、D-アミノ酸同様ペプチドへの連続導入効率が低いL-プロリンを用いて、ペプチド新生鎖配列依存的な導入効率を網羅的に評価する試験管内系の構築に成功し、導入効率を制御するペプチド新生鎖配列の傾向の分析に成功した。この結果に基づいて、今年度はプロリンに焦点を当ててこのような現象が生体内の翻訳系でおこるか検証した。検証には配列中にポリプロリンモチーフを含むタンパク質配列を複数選択し、これらをコードしたプラスミドDNAを調整した後これを用いて大腸菌を形質転換しタンパク質を発現した。タンパク質を精製した後、プロテアーゼを用いて消化した後、LC-MSを用いてそれぞれの配列を決定した。その結果、試験管内系で得られた結果と同一の結果を得ることができ、上記の現象が生体内の翻訳系でも起きることが実証された。現在これらの結果をまとめて投稿論文を作成中である。

这项研究旨在开发突变的核糖体，通过使用D-氨基酸将肽链的效率分类为肽链，可以通过对肽链的序列进行分类，从而有效地将D-氨基酸引入任何肽链中。预计含有D-氨基酸的肽是由于其高蛋白酶耐药性而长时间在体内发育的肽药物的基础。最近对引入D-氨基酸的tRNA的改进进行了优化，使得连续将D-氨基酸引入肽成为可能，但是与L-氨基酸相比，引入效率仍然非常低。在这项研究中，基于以下发现：D-氨基酸转移效率取决于引入肽的肽的序列，我们旨在通过优化核糖体的隧道来提高转移效率，通过该核糖体的隧道通过该肽的肽段通过，肽片的新生链通过。去年，L-Proline成功地构建了一种体外系统，其连续转移效率较低，其连续转移效率很低，该肽构建了一种全面评估转移效率依赖于肽的新生链序列的转移效率，并成功地分析了控制转移效率的肽潜在链序列中的趋势。基于这些结果，今年我们专注于脯氨酸，并检查了这种现象是否发生在体内翻译系统中。为了进行验证，在序列中选择了含有多产序列的多种蛋白质序列，并调整了编码的质粒DNA，并使用大肠杆菌转化蛋白质以表达蛋白质。纯化蛋白质，用蛋白酶消化，然后使用LC-MS确定各个序列。结果，与在体外系统中获得的结果相同，并证明上述现象也发生在体内翻译系统中。我们目前正在编译这些结果以创建提交的论文。

项目成果

Comprehensive elucidation of effect of nascent peptide sequences and EF-G concentration on incorporation of prolines in translation

全面阐明新生肽序列和 EF-G 浓度对翻译中脯氨酸掺入的影响

• 发表时间: 2018
• 作者: Kenya Tajima;Takayuki Katoh;Hiroaki Suga
• 通讯作者: Hiroaki Suga

プロリンの翻訳導入に対する新生ペプチド配列とEF-G濃度の影響の網羅的評価

综合评价新生肽序列和EF-G浓度对脯氨酸翻译引入的影响

• 发表时间: 2018
• 作者: 田島研也;加藤敬行;菅裕明
• 通讯作者: 菅裕明

プロリンの翻訳導入に対するペプチド新生鎖配列とEF-G濃度の影響の網羅的評価

综合评价肽新生链序列和EF-G浓度对脯氨酸翻译引入的影响

• 发表时间: 2018
• 作者: 田島研也;加藤敬行;菅裕明
• 通讯作者: 菅裕明

Comprehensive elucidation of effect nascent peptide sequences and EF -G concentration on incorporation of prolines in translation

全面阐明新生肽序列和 EF -G 浓度对翻译中脯氨酸掺入的影响

• 发表时间: 2019
• 期刊: Peptide Science 2018: Proceedings of the 10th International Peptide Symposium / The 55th Japanese Peptide Symposium
• 作者: Kenya Tajima;Takayuki Katoh;Hiroaki Suga
• 通讯作者: Hiroaki Suga