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チロシンキナーゼ受容体Ｍｅｔによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明

阐明酪氨酸激酶受体Met信号转导机制的结构原理

基本信息

批准号：
18J12469
负责人：
中村希
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Metによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明に向けて、Metの細胞外領域断片を多量に精製し、環状ペプチド(aMD4あるいはaMD5)との複合体結晶化することを計画していた。Metの細胞外領域はN末端からSema、PSIおよび4つのIPTドメインで構成されているが、環状ペプチドのMet結合部位は分かっていない。環状ペプチドの結合に関わらないドメインがないMet断片とペプチドの共結晶化を目指し、(1)Met細胞外領域をドメインごとに削った断片の調整および(2)ペプチドのおおまかな結合領域の探索の2点を行った。(1)Met細胞外領域断片の調整では、断片のC末端に付加するタグの検討を行った。Met細胞外領域の断片にHisタグを付加すると、IPTドメインを複数欠損した断片の発現が激減する。そこでC末端にヒト抗体IgG1由来のFcドメインを付加した。Fcの改良を行った末、全てMet断片で発現量と安定性が向上した。Fcが付加されたMet断片はProtein A セファロースによって単離でき、ゲル濾過法を組み合わせ高純度に精製する手法を確立した。(2)ペプチドの結合領域の探索では、ペプチドとの共結晶化に最適なMet断片を選ぶためにプルダウンアッセイ法によって結合実験をした。２種類のペプチドはMet細胞外領域全長や、C末端からIPTドメインを3つ削ったMet断片には結合できるが、すべてのIPTドメインを欠失した断片には結合できなかった。さらにSemaドメインも結合に必須であることも判明し、ペプチドとの共結晶化にはMet(Sema-PSI-IPT1)が必要最小の断片であること判断した。Metのアゴニストとして働く2量体ペプチドはMetのN末端側に結合することで、Metを活性型の2量体構造へ構造変化させキナーゼ領域の活性化が起こすことを示唆した興味深い結果である。

The structure principle of Met and its extracellular domain fragments are explained, and the crystallization of Met and its extracellular domain fragments is planned. Met extracellular domain is composed of N-terminal, PSI and IPT binding sites, and ring binding sites are composed of N-terminal and IPT binding sites. 2 points for exploration of the domain of met-binding:(1) Met-extracellular domain: (2) Met-extracellular domain: (3) Met-extracellular domain: (4) Met-extracellular domain: (5) Met-extracellular domain: (6) Met-extracellular domain: (7) Met-extracellular domain: (8) Met-extracellular domain: (1) The regulation of Met extracellular domain fragments was discussed. Meta extracellular domain fragments increase, IPT domain fragments increase and decrease. C-terminal antibody IgG1 is derived from the Fc region. The improvement of Fc is due to the improvement of stability and stability. Fc-Met fragment was purified by filtration and purification. (2)The exploration of the binding domain of the crystal is carried out by the method of co-crystallization. 2. The total length of the extracellular domain, the C-terminal IPT domain and the 3-terminal fragment of Met are combined, and the IPT domain and the 3-terminal fragment of Met are combined. The Sema must be identified and the co-crystallization must be identified (Sema-PSI-IPT1). Met's N-terminal binding to the 2-dimensional structure of the active form of Met is a result of the activation of the 2-dimensional structure of Met.