チロシンキナーゼ受容体Ｍｅｔによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明

阐明酪氨酸激酶受体Met信号转导机制的结构原理

• 批准号: 18J12469
• 负责人: 中村 希
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12469/
• 关键词: X線結晶構造解析; シグナル伝達機構; 蛋白質間相互作用; 環状ペプチド; チロシンキナーゼ受容体; 細胞外

Metによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明に向けて、Metの細胞外領域断片を多量に精製し、環状ペプチド(aMD4あるいはaMD5)との複合体結晶化することを計画していた。Metの細胞外領域はN末端からSema、PSIおよび4つのIPTドメインで構成されているが、環状ペプチドのMet結合部位は分かっていない。環状ペプチドの結合に関わらないドメインがないMet断片とペプチドの共結晶化を目指し、(1)Met細胞外領域をドメインごとに削った断片の調整および(2)ペプチドのおおまかな結合領域の探索の2点を行った。(1)Met細胞外領域断片の調整では、断片のC末端に付加するタグの検討を行った。Met細胞外領域の断片にHisタグを付加すると、IPTドメインを複数欠損した断片の発現が激減する。そこでC末端にヒト抗体IgG1由来のFcドメインを付加した。Fcの改良を行った末、全てMet断片で発現量と安定性が向上した。Fcが付加されたMet断片はProtein A セファロースによって単離でき、ゲル濾過法を組み合わせ高純度に精製する手法を確立した。(2)ペプチドの結合領域の探索では、ペプチドとの共結晶化に最適なMet断片を選ぶためにプルダウンアッセイ法によって結合実験をした。２種類のペプチドはMet細胞外領域全長や、C末端からIPTドメインを3つ削ったMet断片には結合できるが、すべてのIPTドメインを欠失した断片には結合できなかった。さらにSemaドメインも結合に必須であることも判明し、ペプチドとの共結晶化にはMet(Sema-PSI-IPT1)が必要最小の断片であること判断した。Metのアゴニストとして働く2量体ペプチドはMetのN末端側に結合することで、Metを活性型の2量体構造へ構造変化させキナーゼ領域の活性化が起こすことを示唆した興味深い結果である。

Met に よ る シ グ ナ ル 伝 of institutions の structure principle の interpret に to け て, Met の extracellular domain を fragment of に refined し, annular ペ プ チ ド (aMD4 あ る い は aMD5) と の complex crystallization す る こ と を project し て い た. Met の extracellular domain は N terminal か ら Sema, PSI お よ び 4 つ の IPT ド メ イ ン で constitute さ れ て い る が, annular ペ プ チ ド の Met combining site は points か っ て い な い. Annular ペ プ チ ド の combining に masato わ ら な い ド メ イ ン が な い Met fragment と ペ プ チ ド の total crystallization を refers し, (1) Met the extracellular domain を ド メ イ ン ご と に cut っ た fragment の adjustment お よ び (2) ペ プ チ ド の お お ま か の な combining field exploration の line 2 を っ た. (1)Met extracellular domain fragment <s:1> adjustment で で, the c-terminal に of the fragment <e:1> is added with するタグ 検 for を line った. Met extracellular domain <s:1> fragments にHisタグを are added すると, IPTドメ <s:1> を を multiple underdamaged <s:1> た fragments <s:1> occur が sharply reduced する. Youdaoplaceholder0 た で c-terminal にヒト antibody IgG1 is derived from a number of Fcドメ <s:1> を を を and added with た た. Fc <s:1> improved を line った end, full てMet fragment で occurrence quantity と stability が increased た. Fc が plus さ れ た Met は fragment Protein A セ フ ァ ロ ー ス に よ っ て 単 from で き, ゲ ル filter way を group み close わ せ high-purity に refined す る gimmick を establish し た. (2) ペ プ チ ド の の combining field exploration で は, ペ プ チ ド と の total crystallization に optimum な Met fragment を choose ぶ た め に プ ル ダ ウ ン ア ッ セ イ method に よ っ て combination be 験 を し た. 2 kinds の ペ プ チ ド は Met over extracellular domain や, C terminal か ら IPT ド メ イ ン を 3 つ cut っ た Met fragment に は combining で き る が, す べ て の IPT ド メ イ ン を owe lost し た fragment に は combining で き な か っ た. さ ら に Sema ド メ イ ン も must combine に で あ る こ と も.at し, ペ プ チ ド と の total crystallization に は Met (Sema - PSI - IPT1) が necessary minimum の fragment で あ る こ と judgment し た. Met の ア ゴ ニ ス ト と し て 働 く 2 quantity body ペ プ チ ド は Met の N terminal side に combining す る こ と で, Met の を activity type 2 quantity body structure へ variations change さ せ キ ナ ー ゼ field の activeness が up こ す こ と を in stopping し た tumblers deep い results で あ る.

项目成果

貴夫, 酒井克也, 松本邦夫, 高木淳一 「ダイナミックな運動性をもつマルチドメイン蛋白質HGFの高難度結晶化の試み

Takao、Katsuya Sakai、Kunio Matsumoto、Junichi Takagi“尝试以高难度结晶 HGF，一种具有动态运动性的多结构域蛋白质”

• 发表时间: 2019
• 作者: 中村希;岩佐奈実;川上紗代子;有森貴夫;酒井克也;松本邦夫;高木淳一
• 通讯作者: 高木淳一

Signal-productive and unproductive Plexin B1 dimer conformations deduced by the binding modes of function-modulating cyclic peptides

由功能调节环肽的结合模式推导出信号产生和非产生信号的 Plexin B1 二聚体构象

• 发表时间: 2019
• 作者: 中村希;岩佐奈実;川上紗代子;有森貴夫;酒井克也;松本邦夫;高木淳一;中村希
• 通讯作者: 中村希