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チロシンキナーゼ受容体Ｍｅｔによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明

阐明酪氨酸激酶受体Met信号转导机制的结构原理

基本信息

批准号：
18J12469
负责人：
中村希
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Metによるシグナル伝達機構の構造的原理の解明に向けて、Metの細胞外領域断片を多量に精製し、環状ペプチド(aMD4あるいはaMD5)との複合体結晶化することを計画していた。Metの細胞外領域はN末端からSema、PSIおよび4つのIPTドメインで構成されているが、環状ペプチドのMet結合部位は分かっていない。環状ペプチドの結合に関わらないドメインがないMet断片とペプチドの共結晶化を目指し、(1)Met細胞外領域をドメインごとに削った断片の調整および(2)ペプチドのおおまかな結合領域の探索の2点を行った。(1)Met細胞外領域断片の調整では、断片のC末端に付加するタグの検討を行った。Met細胞外領域の断片にHisタグを付加すると、IPTドメインを複数欠損した断片の発現が激減する。そこでC末端にヒト抗体IgG1由来のFcドメインを付加した。Fcの改良を行った末、全てMet断片で発現量と安定性が向上した。Fcが付加されたMet断片はProtein A セファロースによって単離でき、ゲル濾過法を組み合わせ高純度に精製する手法を確立した。(2)ペプチドの結合領域の探索では、ペプチドとの共結晶化に最適なMet断片を選ぶためにプルダウンアッセイ法によって結合実験をした。２種類のペプチドはMet細胞外領域全長や、C末端からIPTドメインを3つ削ったMet断片には結合できるが、すべてのIPTドメインを欠失した断片には結合できなかった。さらにSemaドメインも結合に必須であることも判明し、ペプチドとの共結晶化にはMet(Sema-PSI-IPT1)が必要最小の断片であること判断した。Metのアゴニストとして働く2量体ペプチドはMetのN末端側に結合することで、Metを活性型の2量体構造へ構造変化させキナーゼ領域の活性化が起こすことを示唆した興味深い結果である。

The principles developed by the Met instrument explain that the extracellular field fragments of the Met chip are highly refined, and that the complex of aMD4 microspheres (aMD4 chips) crystallizes the mechanical engineering program. In the extracellular field of Met, the N-terminal of Sema, the IPT of PSI, and the joint of IPT and Met in the extracellular field are divided into two parts. The environmental monitoring equipment is used to detect Met fragments. The results show that the target is crystallized, (1) the extracellular domain of the Met is cut, the fragments are cut, and the whole process is completed. (2) the scanning electron microscope is used to explore the two-point operation in the field. (1) the extracellular domain of the Met fragment is divided into two parts: the C-terminal part of the fragment and the C-terminal part of the fragment. The Met extracellular domain fragment, the His fragment, the IPT fragment, the IPT fragment, the extracellular domain fragment, the The origin of the C-terminal antibody IgG1 is Fc. At the end of the Fc improvement line, the whole Met fragment was measured and the stability was improved. Fc pays for Met fragments, Protein A fragments, testing devices, and testing procedures to ensure the accuracy of the device. (2) combined with the field exploration and analysis, the most advanced Met fragments were selected to combine the experimental data with the experimental data. 2. The whole length of the extracellular field, the C-terminal IPT terminal, the full length of the extracellular field, the whole length of the extracellular field, the C-terminal IPT, the C-terminal, the whole extracellular field, the C-terminal, the whole extracellular field, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the Met, the whole, the whole extracellular field, the whole extracellular field, the C-terminal, the Met, the whole extracellular domain, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, the whole extracellular domain, the C-terminal, It is necessary to determine the minimum size of the Met (Sema-PSI-IPT1) that is necessary for the combination of the Sema system and the computer. The Met measurement system was used to measure the body weight of the body. The N-terminal measurement of the Met was combined with the measurement of the active body mass of the Met. The results showed that there was a profound effect on the quality of the body.