転写因子ＣＲＥＢ活性のｉｎ　ｖｉｖｏ動態可視化による、長期記憶形成の機序解明

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長期記憶獲得の機序において、細胞内シグナルの活性化が重要であることが知られている。神経活動によってカルシウム下流の細胞内シグナルが活性化され、転写因子CREBがリン酸化されることで、神経活動依存的に遺伝子を発現した細胞に、記憶の痕跡が残ることが示唆されている。よって、マウス生体内において、神経活動と細胞内シグナル活性化の動態と相互作用を同時に可視化する技術は、記憶形成メカニズムの解明に有用であると考えられる。近年のカルシウムプローブの改良により、数百から数千個の神経細胞の活動を一度に可視化できるようになってきている。しかし、カルシウムシグナルと同時に可視化可能な、マウス脳において単一細胞レベルで細胞内シグナルを検出できるプローブはほとんどない。よって本研究では、CREBに着目し、その蛍光プローブの開発と特徴づけを目指した。昨年度は、CREBリン酸化プローブの構築と検定を行った。コンストラクトをデザインし、最適化のためのスクリーニングを実施し、蛍光変化が最良であったものをXCREB-Gと名付けた。精製タンパクや培養神経細胞を用いて、XCREB-Gの蛍光変化が、CREB-Ser133のリン酸化に依存していることを確認した。本年度では、生きたマウスの1次視覚野第2/3層の細胞にXCREB-Gを発現させ、二光子励起顕微鏡で観察した。一度のイメージングにより数百個の細胞からシグナルを検出し、視覚刺激に応答してCREBリン酸化を起こす細胞集団を検出した。更に、神経活動とCREBリン酸化を、in vivoで同時に可視化する実験を行った。XCREB-Gと共に、赤色カルシウムセンサーであるXCaMP-Rを発現させ、二光子励起顕微鏡で2色同時に観察した。方位選択性神経細胞において、視覚刺激へのカルシウム応答とCREBリン酸化応答を同時に可視化し、それぞれのパターンの間の規則性を解明した。