犬種特異的な炎症性腸疾患における炎症と癌化に関与する遺伝子の探索と機能解析

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本年度は、症例対照研究を行い、PLG遺伝子を犬の炎症性結直腸ポリープ疾患感受性遺伝子の一つとして選定した。罹患したミニチュア・ダックスフント（症例群）と罹患していないミニチュア・ダックスフント（対照群）の血液からDNAを抽出し、これまでの研究で選定した候補遺伝子の変異領域をPCR法で増幅した後にシーケンス解析を行った。その結果、PLG 遺伝子に認められたミスセンス変異（c.478A>T p.Asn160Tyr）のアレル頻度が疾患群で有意に高く、炎症性結直腸ポリープ発症との関連が示唆された。PLG遺伝子は、セリンプロテアーゼの一つであるプラスミンの酵素前駆体、プラスミノーゲンをコードする遺伝子である。プラスミノーゲンおよびプラスミンは線溶系において主たる役割を果たしている一方で、炎症細胞の遊走、腫瘍細胞の浸潤ならびに炎症性サイトカインの産生に関与していることが明らかになっている。そこで、炎症性結直腸ポリープの病変局所におけるプラスミン活性をザイモグラフィーにより検討した結果、病変部のプラスミン活性はコントロールに比べて有意に上昇していた。以上の結果から、PLG遺伝子に認められた変異は、プラスミン活性を増大させることで炎症性結直腸ポリープ発症と関連する可能性が考えられた。次に、PLG c.478A>T p.Asn160Tyrの病態における役割を明らかにするため、犬プラスミノーゲンの組換えタンパク質を作製した。犬PLG遺伝子をクローニングし、哺乳類細胞を用いてタンパク質を発現させた。発現させたタンパクを含む上清を用いてザイモグラフィーを行ったところ、プラスミン活性が確認され、今後の機能試験に使用できることを確認した。変異型に関しては、PCR法を用いたSite-directed mutagenesisによりc.478A>Tの変異を含むプラスミドを作製した。