グルタチオン代謝を担う古典的酵素の新規機能：破骨細胞活性化の構造基盤

负责谷胱甘肽代谢的经典酶的新功能：破骨细胞激活的结构基础

基本信息

批准号：
18J22606
负责人：
高尾春奈
金额：
$ 1.98万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）の分子機能の解明を進めていく中で、酵素活性の分子機能に関して進展があった。hGGTの基質認識機構を解明するために、５種類の基質結合アナログ型阻害剤を用いた結晶を析出させて構造解析をした。これらの解析から、hGGT-基質結合アナログ型阻害剤複合体の構造決定に成功した。しかし、グルタチオン（GSH）のCys-Gly領域に相当する電子密度が3箇所に見られた。hGGTは転移酵素としての一面を持つため、これら3箇所の電子密度はアクセプター基質由来の電子密度の可能性が示唆された。そこで、hGGT-基質結合アナログ型阻害剤複合体にジペプチド（アクセプター基質）を添加して結晶を作製した。hGGT-基質結合アナログ型阻害剤-アクセプター基質複合体の結晶は析出したが、構造解析までには至らなかった。また、これまでのhGGTの構造解析の結果から、申請者は分子表面に存在するCys50-Cys74およびCys192-Cys196がhGGTのダイナミックな構造変化に関与すると予想し、これらのCys残基に変異導入を試みた。変異導入による酵素活性の低下から、hGGT変異体の発現が追えなくなることが懸念された。そこで、hGGTが糖鎖修飾を受けることに着目し、糖鎖をトラップするカラムを用いることで精製過程を簡易化させることができた。さらに、酵素活性が消失したhGGTの変異体を検出するために、hGGT標品からポリクローナル抗体を作製した。ELISAによる力価を評価した結果、高感度の抗hGGT抗体であることが明らかとなった。今後、抗体による特異的なアフィニティー精製を試みる予定である。

当我们继续阐明γ-谷氨酰基肽酶（GGT）的分子功能时，在酶活性的分子功能方面取得了进展。为了澄清HGGT的底物识别机制，沉淀了使用五个不同底物结合的类似物抑制剂的晶体，并进行了结构分析。这些分析已成功确定了HGGT-Substrate结合模拟抑制剂复合物的结构。但是，在三个位置发现了与谷胱甘肽（GSH）的Cys-Gly区域相对应的电子密度。由于HGGT具有转移酶的一面，因此这三个位置的电子密度表明，从受体底物衍生的电子密度是可能的。因此，将二肽（受体底物）添加到HGGT-SUBSTRATE结合的模拟类型抑制剂络合物中以制备晶体。 HGGT - 基底结合抑制剂抑制剂底物复合物的晶体沉淀出来，但没有达到结构分析。此外，根据HGGT先前的结构分析的结果，申请人预测，在分子表面上存在的Cys50-Cys74和Cys192-Cys196将与HGGT的动态结构变化有关，并试图将诱变引入这些CYS残基。人们担心由于诱变引起的酶活性降低，HGGT突变体的表达将无法遵循。因此，着眼于进行聚糖修饰的HGGT，使用捕获聚糖的列来简化纯化过程。此外，从HGGT制剂中产生多克隆抗体，以检测损失其酶活性的HGGT突变体。对ELISA的滴度的评估表明，它是一种高度敏感的抗HGGT抗体。将来，将尝试使用抗体的特定亲和力纯化。