細胞接着における複数の蛋白質間相互作用を選択的に制御可能な化学遺伝学法の開発

开发一种化学遗传方法，可以选择性控制细胞粘附中的多种蛋白质-蛋白质相互作用

基本信息

批准号：
22J01075
负责人：
妹尾暁暢
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-22 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22J01075/
关键词：
細胞接着

项目摘要

本研究では細胞接着蛋白質であるN-カドヘリンが持つ複数の蛋白質-蛋白質間相互作用を区別して制御する技術の開発を行った。蛋白質-蛋白質間相互作用を実測するため、表面プラズモン共鳴法を活用した相互作用測定系の構築を行った。センサー基板上にカドヘリン分子をアミンカップリング法で固定化すると、顕著な蛋白質活性の低下がみられた。そこで、ビオチン-ストレプトアビジンキャプチャー法での固定化方法へと切り替えるべくAvi-tagを付加した組換え蛋白質の調製およびビオチン化反応の進行を確認した。この系を用いれば蛋白質-蛋白質間相互作用を制御できる分子の探索・評価を進めることができる。また、既に取得していたカドヘリン阻害剤に関して上記の系を用いた相互作用の阻害試験を行った。その結果カドヘリンが持つ３種類の相互作用の内、１種類のみを阻害している可能性が示唆された。分子動力学的シミュレーションと合わせることによって、その阻害メカニズムは相互作用中間体の構造を変化させることに由来するメカニズムであることが示唆された。さらに、細胞レベルでの測定系の立ち上げも行った。本研究ではモデル細胞の他にカドヘリンを内在的に発現している細胞の利用も検討している。そのような細胞株を購入し、ウェスタンブロッティングによって目的のカドヘリン分子の発現を確認した。さらに免疫染色によって膜上に局在しているカドヘリン分子も確認する系の構築が進んでいる。上記のin vitroのアッセイ系においてて蛋白質-蛋白質間相互作用を制御できる分子が見つかれば、その分子を細胞に添加した際にカドヘリンの膜状の局在がどのように変化していくかを追跡できるようになると期待される。

在这项研究中，我们开发了一项技术来区分和控制N-钙粘蛋白（细胞粘附蛋白）的多种蛋白质 - 蛋白质相互作用。为了实际测量蛋白质 - 蛋白质相互作用，使用表面等离子体共振构建了相互作用测量系统。当通过胺偶联将钙粘蛋白分子固定在传感器底物上时，观察到蛋白质活性显着降低。因此，为了使用生物素 - 链霉亲和素捕获方法切换到固定法，确认了重组蛋白质与添加AVI-TAG的制备，并确认了生物素化反应的进展。使用该系统，可以推进可以控制蛋白质蛋白质相互作用的分子的搜索和评估。另外，对已经获得的钙粘蛋白抑制剂进行了对使用上述系统的相互作用的抑制测试。这表明钙粘蛋白的三种相互作用中只有一种可以抑制。再加上分子动力学模拟，建议抑制机制是一种因改变相互作用中间体的结构而得出的机制。此外，还在细胞水平上启动了测量系统。除模型细胞外，本研究还检查了内源表达钙粘蛋白的细胞的使用。购买了这种细胞系，并通过蛋白质印迹确认靶核蛋白分子的表达。此外，正在构建系统以确认通过免疫染色在膜上定位在膜上的钙粘蛋白分子。如果可以在上述体外测定系统中找到能够控制蛋白质蛋白质相互作用的分子，则可以预期，当分子添加到细胞中时，可以跟踪钙粘蛋白的膜样定位。