Development of a large-scale screening technology platform for the discovery of antagonistic microorganisms of pathogenic bacteria.

本研究は、微小液滴技術を用いて植物の土壌病害菌の拮抗微生物を土壌中からハイスループットに単離する大規模スクリーニング技術の開発を目的として、以下の実験を行った。まず、青枯病菌GFP標識株（8107-GFP株）の生育培地をさまざまな組成や培養条件で検討した結果、mGAM培地を9種類の市販培地から選抜した。mGAM培地は培地の粘度が高いため、マイクロ流路におけるオイルとサンプルの送液圧力を水で作成する時よりも下げて微小液滴を作成した。8107-GFP株の微小液滴での培養条件は、封入菌体数は8細胞、培養日数は3日間、培養温度は25度とした。次にモデル実験系を構築するために、モデル拮抗微生物を理化学研究所BRCの土壌から単離した。このモデル拮抗微生物#3-8A株は、プレート上での対峙培養を行うと、8107-GFP株に対してハローを形成し、生育を強く阻害することがわかった。この#3-8A株を、微小液滴内に8107-GFP株と共封入すると、#3-8A株の封入された液滴を増やすと8107-GFP株由来のGFP蛍光を発する液滴数が少なくなった。申請後に発売された微小液滴選抜・分注装置であるOnchip-Selectorを年度途中で購入できたため、Onchip-Selectorを用いてGFP由来の蛍光が減衰した液滴を分取したところ、その液滴から培養した微生物はGFP蛍光を持たず、8107-GFP株に対してハローを形成し、生育を強く阻害したことから、#3-8A株であることが推測された。このことから、GFP蛍光強度を標識とした拮抗微生物スクリーニングが可能であることがわかり、モデル実験系の構築に成功した。現在この実験系を用いて、土壌よりミリオンスクリーニングを行い、拮抗微生物候補株として15属1211株の取得に成功している。

本研究は、微小液滴技術を用いて植物の土壌病害菌の拮抗微生物を土壌中からハイスループットに単離する大規模スクリーニング技術の開発を目的として、以下の実験を行った。まず、青枯病菌GFP標識株（8107-GFP株）の生育培地をさまざまな組成や培養条件で検討した結果、mGAM培地を9種類の市販培地から選抜した。mGAM培地は培地の粘度が高いため、マイクロ流路におけるオイルとサンプルの送液圧力を水で作成する時よりも下げて微小液滴を作成した。8107-GFP株の微小液滴での培養条件は、封入菌体数は8細胞、培養日数は3日間、培養温度は25度とした。次にモデル実験系を構築するために、モデル拮抗微生物を理化学研究所BRCの土壌から単離した。このモデル拮抗微生物#3-8A株は、プレート上での対峙培養を行うと、8107-GFP株に対してハローを形成し、生育を強く阻害することがわかった。この#3-8A株を、微小液滴内に8107-GFP株と共封入すると、#3-8A株の封入された液滴を増やすと8107-GFP株由来のGFP蛍光を発する液滴数が少なくなった。申請後に発売された微小液滴選抜・分注装置であるOnchip-Selectorを年度途中で購入できたため、Onchip-Selectorを用いてGFP由来の蛍光が減衰した液滴を分取したところ、その液滴から培養した微生物はGFP蛍光を持たず、8107-GFP株に対してハローを形成し、生育を強く阻害したことから、#3-8A株であることが推測された。このことから、GFP蛍光強度を標識とした拮抗微生物スクリーニングが可能であることがわかり、モデル実験系の構築に成功した。現在この実験系を用いて、土壌よりミリオンスクリーニングを行い、拮抗微生物候補株として15属1211株の取得に成功している。