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FIB加工薄膜における微生物その場検出法の開発

FIB处理薄膜中微生物原位检测方法的开发

基本信息

批准号：
21K18658
负责人：
白石史人
金额：
$ 3.99万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K18658/
关键词：
集束イオンビーム加工微生物 FIB加工

项目摘要

昨年度の検討から，SYBR Green Iが走査型透過X線顕微鏡での検出に適していないことが明らかとなったため，今年度は計画通り，他の標識物質の探索を行った．まず，以下の20種類の物質で標識されたEUB338のFISHプローブに対し（Cy3-tyramide，Cy3.5，Cy5，BIO，BIOdT，DBCOTEG，AmC12，AmC3，2OMeA，5MedC，BHQ1dT，BHQ2dT，BioON，BioTEG，PHO，AmC6，DeoxyInosine I，DeoxyInosine U，Azido，Alkyne），走査型透過X線顕微鏡によって炭素と窒素のNEXAFSスペクトルを取得した．その結果，Cy3-tyramideの炭素スペクトルには約285.2 eVと約285.8 eVに特徴的なピークが認められた．そこで，Cy3-tyramideによるCARD-FISHを適用した大腸菌をδ-MnO2と混合し，それらを炭素支持膜付き銅グリッド上に載せて走査型透過X線顕微鏡分析を行った．その結果，蛍光観察でCARD-FISH標識されていることが明らかな大腸菌からは，タンパク質由来の約288.2 eVのピークに加え，約285.2 eVのピークも得られた．このピークはCy3-tyramideのみの場合に比べると小さく，また約285.8 eVのピークは認識できなかったが，CARD-FISH標識されている場所に特異的に分布したことから，Cy3-tyramideに由来するものと思われる．これらのことから，検討した標識物質の中では，Cy3-tyramideが走査型透過X線顕微鏡による検出に最も適していると結論された．本年度はまた，新手法の潜在的適用対象である様々なマンガン・炭酸塩試料に関しても，予察的検討を開始した．

SYBR Green I was examined by X-ray microscopes yesterday, and this year it is planned to explore its marker substances. The following 20 species of substances were identified by FISH for EUB338 (Cy3-thyramide, Cy3.5, Cy5, BIO, BIOdT, DBCOTEG, AmC12, AmC3, 2OMeA, 5MedC, BHQ1dT, BHQ2dT, BioON, BioTEG, PHO, AmC6, DeoxyInosine I, DeoxyInosine U, Azido, Alkyne), and were identified by X-ray microscopy for NEXAFS. As a result, the carbon emission of Cy3-acrylamide is about 285.2 eV ~ 285.8 eV. Card-FISH was applied to Escherichia coli, δ-MnO2, and mixtures of Cy3-tryptamine and Cy3-tryptamine. As a result, CARD-FISH identification was detected at about 288.2 eV. The CARD-FISH marker is a site-specific distribution of Cy3-thyramide, which is about 285.8 eV lower than that of Cy3-thyramide. In this study, Cy3-thyramide was found to be the most suitable marker for X-ray microscopy. This year, the potential application of the new method is discussed.