FIB加工薄膜における微生物その場検出法の開発

昨年度の検討から，SYBR Green Iが走査型透過X線顕微鏡での検出に適していないことが明らかとなったため，今年度は計画通り，他の標識物質の探索を行った．まず，以下の20種類の物質で標識されたEUB338のFISHプローブに対し（Cy3-tyramide，Cy3.5，Cy5，BIO，BIOdT，DBCOTEG，AmC12，AmC3，2OMeA，5MedC，BHQ1dT，BHQ2dT，BioON，BioTEG，PHO，AmC6，DeoxyInosine I，DeoxyInosine U，Azido，Alkyne），走査型透過X線顕微鏡によって炭素と窒素のNEXAFSスペクトルを取得した．その結果，Cy3-tyramideの炭素スペクトルには約285.2 eVと約285.8 eVに特徴的なピークが認められた．そこで，Cy3-tyramideによるCARD-FISHを適用した大腸菌をδ-MnO2と混合し，それらを炭素支持膜付き銅グリッド上に載せて走査型透過X線顕微鏡分析を行った．その結果，蛍光観察でCARD-FISH標識されていることが明らかな大腸菌からは，タンパク質由来の約288.2 eVのピークに加え，約285.2 eVのピークも得られた．このピークはCy3-tyramideのみの場合に比べると小さく，また約285.8 eVのピークは認識できなかったが，CARD-FISH標識されている場所に特異的に分布したことから，Cy3-tyramideに由来するものと思われる．これらのことから，検討した標識物質の中では，Cy3-tyramideが走査型透過X線顕微鏡による検出に最も適していると結論された．本年度はまた，新手法の潜在的適用対象である様々なマンガン・炭酸塩試料に関しても，予察的検討を開始した．

昨年度の検討から，SYBR Green Iが走査型透過X線顕微鏡での検出に適していないことが明らかとなったため，今年度は計画通り，他の標識物質の探索を行った．まず，以下の20種類の物質で標識されたEUB338のFISHプローブに対し（Cy3-tyramide，Cy3.5，Cy5，BIO，BIOdT，DBCOTEG，AmC12，AmC3，2OMeA，5MedC，BHQ1dT，BHQ2dT，BioON，BioTEG，PHO，AmC6，DeoxyInosine I，DeoxyInosine U，Azido，Alkyne），走査型透過X線顕微鏡によって炭素と窒素のNEXAFSスペクトルを取得した．その結果，Cy3-tyramideの炭素スペクトルには約285.2 eVと約285.8 eVに特徴的なピークが認められた．そこで，Cy3-tyramideによるCARD-FISHを適用した大腸菌をδ-MnO2と混合し，それらを炭素支持膜付き銅グリッド上に載せて走査型透過X線顕微鏡分析を行った．その結果，蛍光観察でCARD-FISH標識されていることが明らかな大腸菌からは，タンパク質由来の約288.2 eVのピークに加え，約285.2 eVのピークも得られた．このピークはCy3-tyramideのみの場合に比べると小さく，また約285.8 eVのピークは認識できなかったが，CARD-FISH標識されている場所に特異的に分布したことから，Cy3-tyramideに由来するものと思われる．これらのことから，検討した標識物質の中では，Cy3-tyramideが走査型透過X線顕微鏡による検出に最も適していると結論された．本年度はまた，新手法の潜在的適用対象である様々なマンガン・炭酸塩試料に関しても，予察的検討を開始した．