ホールマウント多重染色標本を用いた組織構築の定量的解析

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本研究は、近年我々の研究グループが開発した迅速組織透明化法（RAP)を用い、発生毒性試験に応用可能な組織構築の定量的解析法を確立することを目的としている。2年目となる令和４年度は、マウス胎児および臓器のWhole mount標本と厚切りスライス標本でRAP-IHCによる免疫染色や各種染色を行い、高速共焦点画像取得が可能なハイスループット細胞機能探索システムを用いて標識構造物の3D像描出を試みた。胎生10日のマウス胎児Whole mount標本をRAP-IHCで染色した。一次抗体には抗Neurofilament抗体、二次抗体にはAlexa fluor 488 anti-mouse IgGを用いた。染色後、高屈折率溶媒で透徹して免疫陽性反応をハイスループット細胞機能探索システムCV7000（横河電機）にて観察・撮像した。20 マイクロメーター毎に合計2 mmの深部スキャンを行って取得した。胎児の矢状断面Zスキャンでは、三叉神経、動眼神経等の脳神経が、両側とも明瞭に検出されており、胎児全体（2 mm厚程度）のＺスキャンが可能であることが示された。神経線維の走行が明瞭に検出され、神経線維の3次元ネットワーク解析への応用が期待できる。現在、CV7000で高速取得した画像を簡便な操作で3次元像に再構築するためのファイル処理プログラムの作成を行っている。